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Microbiología Estructural y Molecular

MIEMBROS

  • Alejandro Buschiazzo, PhD (Investigador Principal)
  • Joaquín Dalla Rizza (Técnico)
  • Juan Andrés Imelio (Estudiante Maestría)
  • Nicole Larrieux (Técnica)
  • Natalia Lisa, PhD (Investigadora postdoctoral)
  • Cecilia Nieves (Estudiante Maestría)
  • Marcos Nieves (Estudiante Doctorado)
  • Fabiana San Martin (Estudiante Doctorado)
  • Felipe Trajtenberg, PhD (Investigador Adjunto)
  • Leticia Zarantonelli, PhD (Investigadora Asociada)
 Miembros anteriores
  • Horacio Botti
  • Mathias Ferrari
  • Sofía Horjales
  • Frank Lehmann
  • Ariel Mechaly (actualmente Investigador Asociado honorario)
  • Natalia Morero
  • Natalia Ruétalo

 

INVESTIGACIÓN

Queremos entender cómo hacen los microorganismos para efectuar procesos biológicos al nivel molecular, centrándonos en algunas funciones vitales como el sensado y procesamiento de señales, y la regulación celular subsecuente para adaptarse y mantener la homeostasis. Nuestras estrategias experimentales combinan microbiología molecular con biología estructural y bioquímica.

Los abordajes estructurales nos llevan también hacia el dominio de la ingeniería de proteínas, y allí el desafío que nos planteamos es el de contribuir con el desarrollo de vacunas contra las enfermedades  infecciosas causadas por los agentes microbios que estudiamos.

Lineas de investigación:

I- Señalización y regulación en microorganismos:

Los sistemas de dos componentes (TCSs) y distintos tipos de proteínas reguladoras en bacterias constituyen los principales grupos de proteínas en los que trabajamos. El motivo central es el de entender cómo usan las células estas proteínas para sensar señales extra- e intra-celulares para luego regular funciones especificas.

TCS

Uno de los organismos en los que nos hemos enfocado en el laboratorio para entender cómo funcionan los sistemas de dos componentes (SDCs), es Bacillus subtilis, un modelo de bacteria Gram+. B. subtilis es una especie de vida libre para la que se dispone de mucha información biológica y una variedad de herramientas genéticas. El SDC DesK-DesR implicado en la regulación de la fluidez de la membrana plasmática, nos ha permitido desentrañar los mecanismos moleculares de transmisión de la señal en histidin-quinasas sensoras, así como la activación de reguladores de respuesta, usando aproximaciones de biología estructural y bioquímica (Albanesi et al. PNAS 2009; Trajtenberg et al. JBC 2010; Trajtenberg et al. mBio 2014).

Fig_DesK

Fig_DesR

Más recientemente hemos extendido el foco en señalización mediada por SDCs en especies patógenas. Para ello estamos estudiando varios SDCs en bacterias espiroquetas del género Leptospira que incluye especies causales de leptospirosis, una zoonosis de relevancia en Uruguay y en nuestra región. Estamos colaborando activamente con los grupos de Albert Ko (Yale University) y Mathieu Picardeau (Institut Pasteur). Hemos progresado en comprender una vía importante que regula el metabolismo de hemo, compuesto crítico para la supervivencia de Leptospira a diferencia de otras espiroquetas. El SDC HemK-HemR, presente tanto en especies patógenas como saprófitas de Leptospira, regula un conjunto de genes codificando enzimas de degradación así como de biosíntesis de humo (Morero et al. Mol Microbiol 2014), y ahora estamos estudiando la(s) señal(es) específica(s) sensada por HemK. También estamos estudiando la biología estructural de SDCs y fosfatasas específicos de especies patógenas de Leptospira, que hemos aislado a través de una aproximación genética de knock-out de genes y verificación de atenuación de virulencia en el modelo agudo de hamster (resultados no publicados). 

II- Estudio del aparato locomotor de Leptospira

Esta línea está enfocada en el estudio de la arquitectura molecular del filamento del flagelo de Leptospira spp. El flagelo periplásmico de las espiroquetas es esencial para que estas bacterias tengan movilidad translacional normal, la cual es fundamental para la virulencia de especies patogénicas. Las bases moleculares que ligan a esta estructura supramolecular con el cuerpo celular, permitiendo el movimiento de natación, son aún desconocidos. Nuestras evidencias muestran que el filamento de Leptospira es más complejo en su constitución proteica que los flagelos de bacterias más estudiadas (en las que el filamento está constituido por una sola especie proteica: la flagelina, como en Salmonella). Así hemos contribuido a descubrir la proteína FcpA, un componente del filamento (Wunder et al. Mol Microbiol 2016) clave para su normal estructura y función. Recientemente hemos resuelto su estructura 3D, y ahora avanzando en el descubrimiento de sus interactores fisiológicos para desplegar su rol en el ensamblaje flagelar.

lepto

III- Aislamiento y tipificación de serovares autóctonos de Leptospira

Esta línea, desarrollada en el marco de un proyecto colaborativo multicéntrico, tiene como objetivo central aislar cepas autóctonas de bacterias del género Leptospira a partir de muestras biológicas de ganado bovino, sospechosos de estar infectados con esta bacteria. Dichos aislamientos están siendo tipificados con técnicas complementarias (serológicas ya presentes en el país, así como introduciendo técnicas moleculares, de mayor sensibilidad/especificidad). Esto permitirá la creación de un cepario de Leptospira, hoy ausente en el dominio público, útil para informar sobre serovares relevantes para la preparación de vacunas de mayor eficacia.

IV- Virología estructural

En colaboración con el equipo liderado por el Prof Otto Pritsch (Institut Pasteur de Montevideo y Fac de Medicina UdelaR), nos hemos enfocado en los aspectos estructurales de la cápside del virus de la leucemia bovina (BLV por sus siglas en inglés). Hemos resuelto la estructura cristalográfica de la cápside nativa del BLV, brindando información detallada sobre los residuos clave en el auto-ensamblado de esta superestructura macromolecular (Obal et al. Science 2015). Nos interesa conocer las interacciones con proteínas de la célula hospedera  para entender mejor los mecanismos que usa el virus para regular el ensamblado y desensamblado durante su ciclo de vida.

capsid3

V- Trabajo en colaboración
  1. Dr Hugo Gramajo (Instituto de Biologia Molecular y Celular IBR, Rosario, Argentina) y su equipo, apuntando a determinar las estructuras cristalográficas de factores de transcripción de Mycobacterium tuberculosis, involucrados en la regulación del metabolismo de lípidos. 
  2. Drs Mathieu Picardeau (Institut Pasteur, Paris, France) y Albert Ko (Yale University, New Haven, USA), trabajando en locomoción de Leptospira y mecanismos moleculares de patogenicidad. 

EDUCACIÓN – CURSOS

Organización de diversos cursos y talleres:

  • Curso “Macromolecular Crystallography: introduction and applications” – 2010 (Institut Pasteur de Montevideo)
  • Escuela “Macromolecular Crystallography School – From data processing to structure refinement and beyond”. Curso co-organizado con CCP4 (UK), aseguramos una periodicidad anual desde el año 2013, año fundacional que fuera realizado en el Institut Pasteur de Montevideo. En años pares (2014, 2016) el curso se realizó en el Instituto de Fisica de Sao Carlos (Univ de Sao Paulo, Sao Carlos, Brasil), y en los impares (2015, próximamente en 2017) en el Inst Pasteur de Montevideo.
  • Taller teórico – práctico: “Isolation of Leptospira spp. strains from field cases of bovine leptospirosis”. 2014 (Institut Pasteur de Montevideo, INIA (estacion La Estanzuela); Universidad de la Republica, Instituto de Higiene, Fac de Medicina; y DILAVE (Min de Ganaderia, Agricutlura y Pesca). Con participación de profesores invitados de la Univ de Massey (New Zealand).
  • Taller “Modern Approaches in Drug Discovery for Neglected Infectious Diseases”. 2014 Institut Pasteur de Montevideo.
  • Taller teórico – práctico: “Integrative methods in Structural Biology to enhance high impact research in health and disease” 2016 Institut Pasteur de Montevideo, co-organizado con University of Oxford y la red europea de biología estructural Instruct. 

Entrenamiento y orientación de estudiantes:

  • 3 estudiantes de grado

  • 3 estudiantes de Maestría

  • 3 estudiantes de Doctorado

  • Supervisión de 3 becarios postdoctorales

  • Entrenamiento de más de 10 estudiantes y pasantes de Uruguay y del Exterior

FINANCIACIÓN

  • Tipificación y diagnóstico de Leptospira spp. por técnicas moleculares : hacia el diseño de vacunas recombinantes”. Agencia Nacional de Investigación e Innovación ANII, Fondo Sectorial Innovagro #FSA_1_2013_1_12557 (Uruguay), 2014-2017. Rol: Investigador Principal. Colaboradores: Vet Alejandra Suanes (Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca, DILAVE) y Dr M Picardeau (Biology of Spirochetes Unit, Inst Pasteur, Francia)
  • Creación y caracterización de un banco de cepas de  Leptospira spp. aisladas de casos de leptospirosis bovina en Uruguay”. Agencia Nacional de Investigación e Innovación ANII, Programa Alianza # ALI_1_2014_1_4982 (Uruguay), 2015-2018. Rol: Investigador Principal. Colaboradores: Prof F Schelotto (Fac de Medicina, Univ de la Republica, Uruguay), Vet Alejandra Suanes (Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca, DILAVE) y Vet F Riet (Instituto Nacional de Investigaciones Agronómicas INIA).
  • Microbiología Integrativa de Agentes Zoonóticos”. Institut Pasteur de Montevideo (Uruguay) y Institut Pasteur (Francia), Unidad Internacional Mixta, 2016-2021. Rol: Investigador Principal. Co-PI: Dr M Picardeau (Institut Pasteur, Francia).
  • Determinación de las características moleculares e inmunológicas de la glicoproteína secretada del virus Ebola”. Institut Pasteur (Francia), program Ebola Task Force 2015-2017. Rol: científico colaborador. (PI: Félix Rey, IPasteur, France).
  • Consolidación del “Centro de Biologia Estructural del Mercosur – CeBEM”. Ministerio de Educación y Cultura (MEC), Uruguay. Dirección de Innovación, Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (DICYT). 2014-2016. Rol: coordinador general; co-gerenciado por A Buschiazzo y R Radi (líderes de los 2 nodos Uruguayos de CeBEM http://www.cebem-lat.org).

 

PUBLICACIONES

Publicaciones últimos 5 años

Trajtenberg FImelio JA, Machado MR, Larrieux N, Marti MA, Obal G, Mechaly AEBuschiazzo A. Regulation of signaling directionality revealed by 3D snapshots of a kinase:regulator complex in action. Elife. 2016 Dec 12;5. pii: e21422. doi: 10.7554/eLife.21422.

Morán-Barrio J*, Lisa MN*Larrieux N, Drusin SI, Viale AM, Moreno DM, Buschiazzo A¶, Vila AJ¶. Crystal structure of the metallo-β-lactamase GOB in the periplasmic dizinc form reveals an unusual metal site. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Sep 23;60(10):6013-22. doi: 10.1128/AAC.01067-16. *[These authors contributed equally to this work]   ¶[Corresponding authors]

Wunder EA, Figueira CP, Benaroudj N, Hu B, Tong BA, Trajtenberg F, Liu J, Reis MG, Charon NW, Buschiazzo A, Picardeau M, Ko AI. A novel flagellar sheath protein, FcpA, determines filament coiling, translational motility and virulence for the Leptospira spirochete. Mol Microbiol. 2016 Aug;101(3):457-70. doi: 10.1111/mmi.13403.

Meyer PA, Socias S, Key J, Ransey E, Tjon EC, Buschiazzo A, et al. Data publication with the structural biology data grid supports live analysis. Nat Commun. 2016 Mar 7;7:10882. doi: 10.1038/ncomms10882

Fouts DE, Matthias MA, Adhikarla H, Adler B, Amorim-Santos L, Berg DE, Bulach D, Buschiazzo A, Chang YF, Galloway RL, Haake DA, Haft DH, Hartskeerl R, Ko AI, Levett PN, Matsunaga J, Mechaly AE, Monk JM, Nascimento AL, Nelson KE, Palsson B, Peacock SJ, Picardeau M, Ricaldi JN, Thaipandungpanit J, Wunder EA Jr, Yang XF, Zhang JJ, Vinetz JM. What Makes a Bacterial Species Pathogenic?:Comparative Genomic Analysis of the Genus Leptospira. PLoS Negl Trop Dis. 2016 Feb 18;10(2):e0004403.

East A, Mechaly AE, Huysmans GH, Bernarde C, Tello-Manigne D, Nadeau N, Pugsley AP, Buschiazzo A, Alzari PM, Bond PJ, Francetic O. Structural Basis of Pullulanase Membrane Binding and Secretion Revealed by X-Ray Crystallography, Molecular Dynamics and Biochemical Analysis. Structure. 2016 Jan 5;24(1):92-104.

Saita E, Abriata LA, Tsai YT, Trajtenberg F, Lemmin T, Buschiazzo A, Dal Peraro M, de Mendoza D, Albanesi D. A coiled coil switch mediates cold sensing by the thermosensory protein DesK. Mol Microbiol. 2015 Oct;98(2):258-71.

Obal G*, Trajtenberg F*, Carrión F, Tomé L, Larrieux N, Zhang X, Pritsch O¶, Buschiazzo A¶. Conformational plasticity of a native retroviral capsid revealed by x-ray crystallography. Science. 2015 Jul 3;349::95-8. *[These authors contributed equally to this work]  ¶[Corresponding authors]

Methot SP, Litzler LC, Trajtenberg F, Zahn A, Robert F, Pelletier J, Buschiazzo A, Magor BG, Di Noia JM. Consecutive interactions with HSP90 and eEF1A underlie a functional maturation and storage pathway of AID in the cytoplasm. J Exp Med. 2015 Apr 6;212(4):581-96.

Trajtenberg F, Albanesi D, Ruétalo N, Botti H, Mechaly AE, Nieves M, Aguilar PS, Cybulski L, Larrieux N, Mendoza D, Buschiazzo A. Allosteric activation of bacterial response regulators: the role of the cognate histidine kinase beyond phosphorylation. (2014) mBio 5:e02105-14.

Morero NR, Botti H, Nitta KR, Carrión F, Obal G, Picardeau M, Buschiazzo A. HemR is an OmpR/PhoB-like response regulator from Leptospira, which simultaneously effects transcriptional activation and repression of key haem metabolism genes. Mol Microbiol. 2014 Oct;94:340-52.

Trajtenberg F*, Altabe S*, Larrieux N, Ficarra F, de Mendoza D, Buschiazzo A, Schujman GE. Structural insights into bacterial resistance to cerulenin. FEBS J. 2014 May;281(10):2324-38. *[These authors contributed equally to this work]

Martinez A, Peluffo G, Petruk AA, Hugo M, Piñeyro D, Demicheli V, Moreno DM, Lima A, Batthyány C, Durán R, Robello C, Martí MA, Larrieux N, Buschiazzo A, Trujillo M, Radi R, Piacenza L. Structural and molecular basis of the peroxynitrite-mediated nitration and inactivation of Trypanosoma cruzi iron-superoxide dismutases (Fe-SODs) A and B: disparate susceptibilities due to the repair of Tyr35 radical by Cys83 in Fe-SODB through intramolecular electron transfer. J Biol Chem. 2014 May 2;289(18):12760-78.

Correa A*, Trajtenberg F*, Obal G, Pritsch O, Dighiero G, Oppezzo P, Buschiazzo A. Structure of a human IgA1 Fab fragment at 1.55 Å resolution: potential effect of the constant domains on antigen-affinity modulation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013 Mar;69(Pt 3):388-97. *[These authors contributed equally to this work]

Albanesi D, Reh G, Guerin ME, Schaeffer F, Debarbouille M, Buschiazzo A, Schujman GE, de Mendoza D, Alzari PM. Structural basis for feed-forward transcriptional regulation of membrane lipid homeostasis in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003108.

Horjales S, Schmidt-Arras D, Limardo RR, Leclercq O, Obal G, Prina E, Turjanski AG, Späth GF, Buschiazzo A. The crystal structure of the MAP kinase LmaMPK10 from Leishmania major reveals parasite-specific features and regulatory mechanisms. Structure. 2012 Oct 10;20(10):1649-60.

Buschiazzo A*, Muiá R, Larrieux N, Pitcovsky T, Mucci J, Campetella O*. Trypanosoma cruzi trans-sialidase in complex with a neutralizing antibody: structure/function studies towards the rational design of inhibitors. PLoS Pathog. 2012 Jan;8(1):e1002474. *[Corresponding authors].

CONTACTO

Alejandro Buschiazzo (alebus@pasteur.edu.uy)