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Cristalografía de Proteínas

MIEMBROS

  • Alejandro Buschiazzo, PhD (Investigador Principal)
  • Joaquín Dalla Rizza (Técnico)
  • Nicole Larrieux (Técnica)
  • Felipe Trajtenberg, PhD (Investigador Adjunto)

Esta Unidad tiene una doble misión :

  1. Hacer investigación científica (ver detalles en Laboratorio de Microbiología Molecular y Estructural)
  2. Mantener una plataforma tecnológica estado del arte para realizar estudios de cristalografía de proteínas
  1. Nuestras líneas de investigación se enfocan en estudios moleculares de proteínas clave en regulación celular y patogenicidad de microorganismos. Nos interesa descubrir la estructura molecular y la función biológica de proteínas implicadas en transducción de señales y regulación de respuestas, con énfasis especial en patógenos humanos y animales. La relación estructura/función de estas especies macromoleculares permite no sólo comprender los procesos biológicos en los que están involucradas, sino que también abren caminos para elaborar estrategias de intervención molecular (ingeniería de proteínas, diseño/optimización de vacunas). Estudiamos diferentes modelos biológicos, en particular bacterianos (Bacillus, Leptospira).
  2. El propósito de la Plataforma de Cristalografía de Proteínas (PXF por sus siglas en inglés Protein Xtallography Facility) es proveer equipamiento, entrenamiento, asistencia, e innovaciones tecnológicas para determinar la estructura tri-dimensional de proteínas y otros ensambles macromolecules. La cristalografía de rayos X es una de las técnicas más poderosas para estudiar las estructuras 3D de macromoléculas y ha transformado nuestra comprensión de procesos biológicos. Esta plataforma permite a los usuarios cristalizar macromoléculas y resolver sus estructuras 3D por difracción de rayos X.

EQUIPOS PRINCIPALES

Robot de cristalización – Honeybee963®

El robot Honeybee963® (Digilab) es un sistema de mesada para la automatización y miniaturización de experimentos de cristalización de proteínas usando el método de difusión de vapor en gota sentada. Los dispensadores synQUAD® combinan válvulas micro-solenoides de alta velocidad con bombas y jeringas de alta resolución, dispensando volúmenes de hasta 100nL. Actualmente utilizamos nanogotas de 200-300nL maximizando las probabilidades de cristalización.

El brazo de 96 agujas permite el dispensado rápido de las soluciones que se encuentran en el reservorio a placas de 96 pocillos. Tres agujas synQUAD® independientes proceden a dispensar volúmenes de hasta tres proteínas distintas, con volúemenes variables elegidos a través de la programación del robot. La automatización permite ensayar cientos de condiciones potenciales de cristalogénesis en cuestión de minutos, permitiendo aumentar el espacio de rastreo, un requisito necesario para aumentar la probabilidad de éxito.

Robot de producción y optimización de cristales – Alchemist DT®

El Alchemist DT ® (Formulatrix) es un robot de mesada de manejo de líquidos para la producción y optimización de condiciones de cristalización. Los líquidos son dispensados en placas SBS, Linbro® o Nextal® de manera confiable, precisa y exacta en un rango de volúmenes entre 1 μl a 10 ml. Debido a su tecnología, la ausencia de tuberías evita el descarte de desechos y elimina toda contaminación cruzada.

El programa informático que acompaña el sistema (CrystalTrak) está diseñado específicamente para cristalografía de proteínas. Una vez que la placa es diseñada, Crystal Trak automáticamente calcula la receta y define las soluciones madre necesarias. 26 soluciones madre pueden ser almacenadas simultáneamente en el equipo. Las herramientas para el manejo de estas soluciones y el rastreo por código de barras aseguran que las soluciones madres correctas y los volúmenes necesarios estén disponibles en el equipo antes de que la placa sea generada.

Generador de rayos X – MicroMax-007HF®

El Micromax007-HF® (Rigaku) es un generador de rayos X con una fuente de diámetro focal efectivo de 0.07mm. Equipado con un ánodo de cobre rotatorio, es capaz de generar una salida de 1200 W y un brillo de 31kW/mm2. En combinación con la óptica instalada (Varimax-HF®, Rigaku), que consite de espejos multicapa confocales, los rayos X enfocados en la muestra cristalina son muy brillantes y pueden utilizarse para tomar medidas con varios propósitos. Podemos resolver estructuras con átomos que dispersan en forma anómala, a la longitud de onda fija de 1.5418Å (como átomos de S, I, Cs, lantánidos, entre los más utilizados). También se pueden resolver estructuras que permitan ser abordadas por reemplazo molecular, y en fin, colectas de datos para el refinamiento de estructuras a alta resolución (por ej incluyendo ligandos, inhibidores, drogas, variantes de proteínas por mutaciones puntuales, etc).

Detector de área de tipo placa de imagen – MAR345®

El detector MAR345® (Mar Research) instalado en una mesa MAR345dtb® es un detector de área de tipo placa de imagen que nos permite colectar datos hasta 1.2Å de resolución gracias a la configuración geométrica que hemos diseñado (aprovechando al máximo el ángulo 2θ). Esta geometría de oscilación según un único ángulo Φ, se acompaña de un conveniente motor que rota según χ que facilita el montado de cristales en condiciones criogénicas. Los ciclos de lectura van desde 108 a 34 segundos, dependiendo del tamaño de los píxeles y del diámetro de la placa efectivamente escaneada.

El sistema de lectura del Mar345 es único en el sentido que utiliza un solo láser de 85mW de alta performance, el cual brinda más de 0.8 µJ/pixel en la placa. Esto asegura que un porcentaje extremadamente alto de centros-F atrapados son transformados en luminiscencia fotoestimulada.

Criosistema de rayos X- 700 series Cryostream®

El Cryostream® (Oxford Cryosystems) permite un flujo laminar continuo de nitrógeno gaseoso a temperaturas criogénicas durante la colecta de datos de difracción. El enfriamiento rápido a 100º Kelvin se alcanza en 20 minutos. Tiene un consumo de nitrógeno líquido bastante bajo, con un flujo variable de 5 a 10 litros/minuto.

Tenemos un sistema accesorio de auto-llenado que utiliza un sensor de nivel en el Dewar del criosistema; este sistema automatiza el rellenado del Dewar durante jornadas de colecta de datos que pueden llevar varias horas o incluso días.

Generador de nitrógeno líquido – LN40®

El LN40® (Rigaku) es una máquina basada en un compresor de helio capaz de producir hasta 40 lts/día de nitrógeno líquido con un altísimo grado de pureza (>98%). La alimentación de gas se asegura tomando aire ambiente, el cual es bombeado usando un sistema de purificación PSA  (por sus siglas en inglés Pressure Swing Adsorption) incluído en el sistema.

La operación del sistema de refrigeración criogénico está basada en un ciclo de expansión de helio en un circuito cerrado Gifford-McMahon (GM). El sistema PSA consiste en dos componentes básicos: un recipiente(s) que contiene un “filtro molecular de carbón” (CMS) y un compresor(es) de aire u otra fuente de aire limpio y seco.

services

PLATAFORMA TECNOLOGICA – SERVICIOS

Para acceder a la plataforma los usuarios deben escribir a pxf@pasteur.edu.uy planteando brevemente la solicitud. Se les proveerá de un formulario a completar, que incluye información sobre el objeto del proyecto, especificaciones sobre la macromolécula de interés y otros detalles. Este será evaluado por la Unidad según su viabilidad técnica y relevancia científica. Todas las solicitudes tendrán una respuesta, y se entrará en contacto directo con el usuario para acordar sobre el camino a seguir.

En todos los casos se procura tener gran flexibilidad, para poder acordar caso por caso, sobre la forma más conveniente de utilizar la plataforma, tanto en el uso del equipamiento como en el apoyo técnico de nuestro personal. El nivel de apoyo a ser brindado por el personal de la Unidad dependerá así de la autonomía del usuario. El uso de equipamiento específico (robots de cristalización y optimización, y difracción de rayos X) estará siempre supervisado por personal de la plataforma. Los eventuales costos para cubrir gastos serán siempre acordados con los usuarios de acuerdo al proyecto y a las preferencias de cada usuario por los distintos ensayos.

Aproximaciones experimentales disponibles para los usuarios:

  • Rastreo de condiciones de cristalización (manual y robótico)

  • Seguimiento y optimización de cristales

  • Ensayos de difracción de rayos X premiminares – testeo y caracterización de cristales

  • Colecta de juegos de datos completos

  • Determinación y análisis de estructura

EDUCACIÓN – CURSOS

Organización de diversos cursos y talleres:

  • Curso “Macromolecular Crystallography: introduction and applications” – 2010 (Institut Pasteur de Montevideo)
  • Escuela “Macromolecular Crystallography School – From data processing to structure refinement and beyond”. Curso co-organizado con CCP4 (UK), aseguramos una periodicidad anual desde el año 2013, año fundacional que fuera realizado en el Institut Pasteur de Montevideo. En años pares (2014, 2016) el curso se realizó en el Instituto de Fisica de Sao Carlos (Univ de Sao Paulo, Sao Carlos, Brasil), y en los impares (2015, próximamente en 2017) en el Inst Pasteur de Montevideo.
  • Taller teórico – práctico: “Isolation of Leptospira spp. strains from field cases of bovine leptospirosis”. 2014 (Institut Pasteur de Montevideo, INIA (estacion La Estanzuela); Universidad de la Republica, Instituto de Higiene, Fac de Medicina; and DILAVE (Min de Ganaderia, Agricutlura y Pesca). Con participación de profesores invitados de la Univ de Massey (New Zealand).
  • Taller “Modern Approaches in Drug Discovery for Neglected Infectious Diseases”. 2014 Institut Pasteur de Montevideo.
  • Taller teórico – práctico: “Integrative methods in Structural Biology to enhance high impact research in health and disease” 2016 Institut Pasteur de Montevideo, co-organizado con University of Oxford y la red europea Instruct. 

Entrenamiento y orientación de estudiantes:

  • 3 estudiantes de grado

  • 3 estudiantes de Maestría

  • 3 estudiantes de Doctorado

  • Supervisión de 3 becarios postdoctorales

  • Entrenamiento de más de 10 estudiantes y pasantes de Uruguay y del Exterior

PUBLICACIONES

(Ultimos 5 años)

Trajtenberg F, Imelio JA, Machado MR, Larrieux N, Marti MA, Obal G, Mechaly AEBuschiazzo A. Regulation of signaling directionality revealed by 3D snapshots of a kinase:regulator complex in action. Elife. 2016 Dec 12;5. pii: e21422. doi: 10.7554/eLife.21422.

Morán-Barrio J*, Lisa MN*, Larrieux N, Drusin SI, Viale AM, Moreno DM, Buschiazzo A¶, Vila AJ¶. Crystal structure of the metallo-β-lactamase GOB in the periplasmic dizinc form reveals an unusual metal site. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Sep 23;60(10):6013-22. doi: 10.1128/AAC.01067-16. *[These authors contributed equally to this work]   ¶[Corresponding authors]

Wunder EA, Figueira CP, Benaroudj N, Hu B, Tong BA, Trajtenberg F, Liu J, Reis MG, Charon NW, Buschiazzo A, Picardeau M, Ko AI. A novel flagellar sheath protein, FcpA, determines filament coiling, translational motility and virulence for the Leptospira spirochete. Mol Microbiol. 2016 Aug;101(3):457-70. doi: 10.1111/mmi.13403.

Meyer PA, Socias S, Key J, Ransey E, Tjon EC, Buschiazzo A, et al. Data publication with the structural biology data grid supports live analysis. Nat Commun. 2016 Mar 7;7:10882. doi: 10.1038/ncomms10882

Fouts DE, Matthias MA, Adhikarla H, Adler B, Amorim-Santos L, Berg DE, Bulach D, Buschiazzo A, Chang YF, Galloway RL, Haake DA, Haft DH, Hartskeerl R, Ko AI, Levett PN, Matsunaga J, Mechaly AE, Monk JM, Nascimento AL, Nelson KE, Palsson B, Peacock SJ, Picardeau M, Ricaldi JN, Thaipandungpanit J, Wunder EA Jr, Yang XF, Zhang JJ, Vinetz JM. What Makes a Bacterial Species Pathogenic?:Comparative Genomic Analysis of the Genus Leptospira. PLoS Negl Trop Dis. 2016 Feb 18;10(2):e0004403.

East A, Mechaly AE, Huysmans GH, Bernarde C, Tello-Manigne D, Nadeau N, Pugsley AP, Buschiazzo A, Alzari PM, Bond PJ, Francetic O. Structural Basis of Pullulanase Membrane Binding and Secretion Revealed by X-Ray Crystallography, Molecular Dynamics and Biochemical Analysis. Structure. 2016 Jan 5;24(1):92-104.

Saita E, Abriata LA, Tsai YT, Trajtenberg F, Lemmin T, Buschiazzo A, Dal Peraro M, de Mendoza D, Albanesi D. A coiled coil switch mediates cold sensing by the thermosensory protein DesK. Mol Microbiol. 2015 Oct;98(2):258-71.

Obal G*, Trajtenberg F*, Carrión F, Tomé L, Larrieux N, Zhang X, Pritsch O¶, Buschiazzo A¶. Conformational plasticity of a native retroviral capsid revealed by x-ray crystallography. Science. 2015 Jul 3;349::95-8. *[These authors contributed equally to this work]  ¶[Corresponding authors]

Methot SP, Litzler LC, Trajtenberg F, Zahn A, Robert F, Pelletier J, Buschiazzo A, Magor BG, Di Noia JM. Consecutive interactions with HSP90 and eEF1A underlie a functional maturation and storage pathway of AID in the cytoplasm. J Exp Med. 2015 Apr 6;212(4):581-96.

Trajtenberg F, Albanesi D, Ruétalo N, Botti H, Mechaly AE, Nieves M, Aguilar PS, Cybulski L, Larrieux N, Mendoza D, Buschiazzo A. Allosteric activation of bacterial response regulators: the role of the cognate histidine kinase beyond phosphorylation. (2014) mBio 5:e02105-14.

Morero NR, Botti H, Nitta KR, Carrión F, Obal G, Picardeau M, Buschiazzo A. HemR is an OmpR/PhoB-like response regulator from Leptospira, which simultaneously effects transcriptional activation and repression of key haem metabolism genes. Mol Microbiol. 2014 Oct;94:340-52.

Trajtenberg F*, Altabe S*, Larrieux N, Ficarra F, de Mendoza D, Buschiazzo A, Schujman GE. Structural insights into bacterial resistance to cerulenin. FEBS J. 2014 May;281(10):2324-38. *[These authors contributed equally to this work]

Martinez A, Peluffo G, Petruk AA, Hugo M, Piñeyro D, Demicheli V, Moreno DM, Lima A, Batthyány C, Durán R, Robello C, Martí MA, Larrieux N, Buschiazzo A, Trujillo M, Radi R, Piacenza L. Structural and molecular basis of the peroxynitrite-mediated nitration and inactivation of Trypanosoma cruzi iron-superoxide dismutases (Fe-SODs) A and B: disparate susceptibilities due to the repair of Tyr35 radical by Cys83 in Fe-SODB through intramolecular electron transfer. J Biol Chem. 2014 May 2;289(18):12760-78.

Correa A*, Trajtenberg F*, Obal G, Pritsch O, Dighiero G, Oppezzo P, Buschiazzo A. Structure of a human IgA1 Fab fragment at 1.55 Å resolution: potential effect of the constant domains on antigen-affinity modulation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013 Mar;69(Pt 3):388-97. *[These authors contributed equally to this work]

Albanesi D, Reh G, Guerin ME, Schaeffer F, Debarbouille M, Buschiazzo A, Schujman GE, de Mendoza D, Alzari PM. Structural basis for feed-forward transcriptional regulation of membrane lipid homeostasis in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003108.

Horjales S, Schmidt-Arras D, Limardo RR, Leclercq O, Obal G, Prina E, Turjanski AG, Späth GF, Buschiazzo A. The crystal structure of the MAP kinase LmaMPK10 from Leishmania major reveals parasite-specific features and regulatory mechanisms. Structure. 2012 Oct 10;20(10):1649-60.

Buschiazzo A*, Muiá R, Larrieux N, Pitcovsky T, Mucci J, Campetella O*. Trypanosoma cruzi trans-sialidase in complex with a neutralizing antibody: structure/function studies towards the rational design of inhibitors. PLoS Pathog. 2012 Jan;8(1):e1002474. *[Corresponding authors].

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pxf@pasteur.edu.uy