Microbiología Estructural y Molecular

>>>Microbiología Estructural y Molecular

El Laboratorio de Microbiología Molecular y Estructural quiere entender cómo hacen las bacterias para percibir señales de su entorno (sensado), y transmitirlas a su interior para disparar respuestas adaptativas (regulación celular). Las bacterias necesitan procesar información de señales para sobrevivir en ambientes que cambian, y particularmente nos interesan estos procesos de “señalización” en bacterias patógenas, determinando mecanismos de patogenicidad o virulencia.

Las proteínas juegan un papel central en Biología. Hay miles de proteínas diferentes, cada una con una forma 3D particular, pues son los dispositivos que tienen los organismos para efectuar los trabajos necesarios para vivir, o bien para enfermar si las cosas de desarreglan. Los métodos que usa el LMME para entender cómo funcionan las proteínas, incluyendo las implicadas en señalización, están comprendidos en la “Biología Estructural” (como la cristalografía por rayos X, que usamos mucho), y permiten literalmente ver las estructuras 3D de las proteínas de interés. Combinando esas imágenes con otras fuentes de información, usando bioquímica, genética y microbiología, se procura entender la función, y luego poder contribuir al desarrollo de estrategias de intervención (por ej, ingeniería de vacunas para controlar las enfermedades causadas por los agentes microbianos).

Entre las bacterias de mayor interés para el grupo están las del género Leptospira, que comprende muchas especies, y al menos 10 que causan una enfermedad seria: la leptospirosis. Esta zoonosis (es decir, que se transmite de animales a humanos) afecta de manera la capacidad reproductiva del ganado bovino en Uruguay y en los seres humanos provoca una enfermedad aguda, a veces grave, para la cual no existen aún vacunas eficaces. Los sistemas de señalización en estas bacterias pueden ser blancos de interés para entender cómo regular su virulencia.


Joaquín Dalla Rizza

Técnico

jdallarizza@pasteur.edu.uy


PhD Camila Hamond

PostDoc

chamond@pasteur.edu.uy


MSc Juan Andrés Imelio

PostDoc, Estudiante de Doctorado

juanimelio@pasteur.edu.uy


Nicole Larrieux

Técnica

nlarrieux@pasteur.edu.uy


Lic. Sofía Lima

Estudiante de Maestría

Lic. Fabiana San Martin

Estudiante de Doctorado

fabism@pasteur.edu.uy


PhD Leticia Zarantonelli

Investigadora INIA Asociada

lzarantonelli@pasteur.edu.uy


PhD Felipe Trajtenberg

Investigador Adjunto

felipet@pasteur.edu.uy


Lic. Marcos Nieves

Estudiante de Doctorado

marcosnieves@pasteur.edu.uy


Lic. Cecilia Nieves

Estudiante de Maestría

cnieves@pasteur.edu.uy

  • Señalización y regulación en microorganismos
    Entre las proteínas de mayor interés se encuentran las que conforman “sistemas de dos componentes” (TCS) en bacterias. Los TCSs son centrales en mediar señalización y regulación. También se estudian otras proteínas reguladoras, aun sin ser miembros de TCSs. La pregunta central detrás de esta línea es ¿cómo usan las células estas proteínas para detectar señales extra- e intra-celulares, regulando luego funciones específicas? Para responder, se investigan bacterias saprófitas (como Bacillus subtilis, Leptospira biflexa), así como también especies patógenas (Leptospira interrogans, L. borgpetersenii, L. noguchii, Enterococcus faecium). En dichos modelos se estudian varios procesos biológicos claves, como la regulación de síntesis de lípidos (Albanesi et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106:16185; Trajtenberg et al., J Biol Chem 2010, 285:24892; Trajtenberg et al., mBio 2014, 5:e02105; Trajtenberg et al., eLife 2016, 5:e21422; Imelio et al., Bio-protocol 2017, 7:e2510), del metabolismo de hemo (Morero et al., Mol Microbiol 2014, 94:340), o bien de la virulencia en patogenicidad (Adhikarla et al., Front Cell Infect Microbiol 2018, 8:45).

  • Biología molecular y estructural de Leptospira
    Distintas especies de Leptospira causan leptospirosis. Esta zoonosis es la más extendida en el mundo, reemergiendo como un problema de salud humana y animal importante. En Uruguay es un problema veterinario significativo. El LMME quiere dilucidar mecanismos moleculares que determinan y/o regulan la virulencia y patogenicidad de estas bacterias. Actualmente hay dos focos de atención: el estudio del aparato locomotor, y la tipificación de especies autóctonas en Uruguay.
    i- Aparato locomotor de Leptospira. La activa movilidad de las leptospiras (natación), es fundamental para la virulencia de las especies patógenas que provocan leptospirosis. La organela esencial para la natación es el flagelo. El LMME está estudiando en gran profundidad la arquitectura molecular del flagelo de Leptospira. El filamento de estos flagelos es de ubicación periplasmática, una característica única de las Espiroquetas, incluyendo parientes de Leptospira, como Treponema pallidum (causal de sífilis) o Borrelia burgdorferi (provoca la enfermedad de Lyme). Nuestro laboratorio, en colaboración con los grupos de Albert Ko y Charles Sindelar (Yale Univ) y Mathieu Picardeau (Inst Pasteur), ha demostrado que el filamento del flagelo de leptospiras es mucho más complejo que los flagelos de modelos bacterianos más conocidos, usados hasta hoy como paradigma del movimiento de natación en bacterias. Por ejemplo, Salmonella y otras enterobacterias, tienen filamentos con una única especie de proteína (flagelina), miestras que Leptospira tiene al menos ocho diferentes (Wunder et al., Mol Microbiol 2016, 101: 457; San Martin et al., Acta Crystallogr F 2017, 73:123; Wunder et al., Front Cell Infect Microbiol 2018, 8:130). Recientemente hemos cristalizado dos de las proteínas nuevas, a partir de leptospiras patógenas y saprófitas (San Martín et al., Acta Crystallogr F 2017, 73:123), hemos resuelto sus estructuras 3D (resultados no publicados) revelando plegamientos absolutamente novedosos, y estamos ahora avanzando en el descubrimiento de sus interactores fisiológicos para llevar adelante sus roles en el ensamblaje flagelar.

    ii- Aislamiento y tipificación de cepas nativas de Leptospira. Esta línea, desarrollada en el contexto de un proyecto multicéntrico colaborativo, tiene como objetivo aislar cepas autóctonas de la bacteria Leptospira a partir de muestras biológicas obtenidas de bovinos infectados, y de otros reservorios animales. Dichos aislamientos se tipifican con técnicas complementarias: métodos serológicos, y también enfoques moleculares más novedosos en el país, logrando en definitiva mayores sensibilidad y especificidad (Zarantonelli et al., PLoS Negl Trop Dis 2018, artículo en prensa). Este esfuerzo ha llevado a la creación de un biobanco de cepas de Leptospira, que hasta ahora no estaba disponible en el dominio público en Uruguay, informando la identidad de los serotipos en circulación. Este cepario será útil en la formulación de vacunas con mayor eficacia, en el mejoramiento de métodos diagnósticos, así como también en investigaciones ulteriores sobre la leptospirosis en Uruguay.

  • Trabajos colaborativos
    El laboratorio colabora con el Dr. Hugo Gramajo (Instituto de Biología Molecular y Celular IBR, Rosario, Argentina) y su equipo, con el objetivo de dilucidar las estructuras cristalinas de los factores de transcripción de Mycobacterium tuberculosis, que participan en la regulación del metabolismo de los lípidos.
    También colabora con el Dr. Mathieu Picardeau (Instituto Pasteur, París, Francia) y el Dr. Albert Ko (Universidad de Yale, New Haven, EE. UU.) en la motilidad de Leptospira y los mecanismos moleculares de la patogénesis de estas bacterias.
    Asimismo, el laboratorio integra un consorcio multicéntrico en Uruguay, trabajando con equipos del Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca (Alejandra Suanes, Rodolfo Rivero, DILAVE, MGAP), el Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (Franklin Riet, INIA), el Departamento de Bacteriología de la Facultad de Medicina (Felipe Schelotto, Instituto de Higiene, Udelar) abordando los problemas del aislamiento, tipificado, diagnóstico y desarrollo de vacunas de Leptospira veterinaria.

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  • Taller teórico-práctico: “Isolation of Leptospira spp. strains from field cases of bovine leptospirosis” (2014) Institut Pasteur de Montevideo, INIA (La Estanzuela); Universidad de la Republica, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina; y DILAVE (Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca). Con participación de profesores invitados de la Universidad de Massey (New Zealand).

  • Taller teórico-práctico: “Integrative methods in Structural Biology to enhance high impact research in health and disease” (2016) Institut Pasteur de Montevideo, co-organizado con University of Oxford y con la Red Europea de Biología Estructural (Instruct).

  • 2018-2021 – “Mecanismo molecular de la señalización en bacterias: la direccionalidad desde la señal a la respuesta” – ANII, Fondo Clemente Estable #FCE_1_2017_1_136291 (Uruguay). Rol: Investigador Responsable (A Buschiazzo).

  • 2017-2021 – “Integrative Microbiology of Zoonotic Agents” – Institut Pasteur (Francia) / Institut Pasteur de Montevideo (Uruguay) – International Joint Units program. Rol: Inv Principal (A Buschiazzo), junto con el Dr M Picardeau (Biology of Spirochetes Unit, Institut Pasteur, Francia)

  • 2017-2018 – “Estudios estructurales y funcionales del endoflagelo de Leptospira: un componente esencial en la patogenicidad de las espiroquetas” – ANII, Fondo Clemente Estable #FCE_3_2016_1_126797 (Uruguay). Rol: Investigador Responsable (F Trajtenberg).

  • 2016-2019 – Diseño y producción de nuevas variantes de la hormona folículo estimulante (FSH) para su empleo en especies de interés productivo. Participación: investigador.

  • 2017-2018 – “Banco de Cepas nativas de enfermedades zoonóticas que afectan al ganado Uruguayo para desarrollos de I+D de la industria Uruguaya”. Ministerio de Industria, Energía y Minería MIEM, programa Fondo Industrial de la Dirección Nacional de Industrias, # 2016-8-2-002671 (Uruguay). Rol: grupo colaborador.

  • 2015-2018 – “Creación y caracterización de un banco de cepas de Leptospira spp. aisladas de casos de leptospirosis bovina en Uruguay”. Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII), Programa Alianzas # ALI_1_2014_1_4982 (Uruguay). Role: Investigador Coordinador (A Buschiazzo). Junto con co-responsables: Prof F Schelotto (Fac de Medicina, Univ de la Republica, Uruguay), Vet A Suanes, R Rivero (DILAVE, MGAP) y Vet F Riet (Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria INIA).

  • 2014-2017 – “Tipificación y diagnóstico de Leptospira spp. usando aproximaciones moleculares: hacia el diseño de vacunas recombinantes” – ANII, Fondo Sectorial Innovagro #FSA_1_2013_1_12557 (Uruguay). Rol: Inv Responsable (A Buschiazzo). Colaboradores: Vet A Suanes (DILAVE-MGAP) y Dr M Picardeau (Biology of Spirochetes Unit, Institut Pasteur, Francia).

  • Adhikarla H, Wunder EA Jr, Mechaly AE, Mehta S, Wang Z, Santos L, Bisht V, Diggle P, Murray G, Adler B, Lopez F, Townsend JP, Groisman E, Picardeau M, Buschiazzo A, Ko AI. (2018) Lvr, a signaling system that controls global gene regulation and virulence in pathogenic Leptospira. Front Cell Infect Microbiol 8:45.

  • Wunder EA Jr, Slamti L, Suwondo DN, Gibson KH, Shang Z, Sindelar CV, Trajtenberg F, Buschiazzo A, Ko AI, Picardeau M. (2018) FcpB is a surface filament protein of the endoflagellum required for the motility of the spirochete Leptospira. Front Cell Infect Microbiol 8:130.

  • Mechaly AE, Soto Diaz S, Sassoon N, Buschiazzo A, Betton JM, Alzari PM. (2017) Structural coupling between autokinase and phosphotransferase reactions in a bacterial histidine kinase. Structure. 25:939-44.

  • San Martin F, Mechaly AE, Larrieux N, Wunder EA Jr, Ko AI, Picardeau M, Trajtenberg F, Buschiazzo A. (2017) Crystallization of FcpA from Leptospira, a novel flagellar protein that is essential for pathogenesis. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73:123-9.

  • Imelio JA, Larrieux N, Mechaly AE, Trajtenberg F, Buschiazzo A. (2017) Snapshots of the signaling complex DesK:DesR in different functional states using rational mutagenesis and X-ray crystallography. Bio-protocol. 7:e2510 (doi 10.21769/BioProtoc.2510)

  • Wunder EA, Figueira CP, Benaroudj N, Hu B, Tong BA, Trajtenberg F, Liu J, Reis MG, Charon NW, Buschiazzo A, Picardeau M & Ko AI. (2016) A novel flagellar sheath protein, FcpA, determines filament coiling, translational motility and virulence for the Leptospira spirochete. Mol Microbiol. 101:457-70.

  • Fouts DE, Matthias MA, Adhikarla H, Adler B, Amorim-Santos L, Berg DE, Bulach D, Buschiazzo A, et al. (2016) What makes a bacterial species pathogenic?: comparative genomic analysis of the genus Leptospira. PLoS Negl Trop Dis. 10:e0004403.

  • Saita E, Abriata LA, Tsai YT, Trajtenberg F, Lemmin T, Buschiazzo A, Dal Peraro M, de Mendoza D, Albanesi D. (2015) A coiled coil switch mediates cold sensing by the thermosensory protein DesK. Mol Microbiol. 98:258-71.

  • Obal G, Trajtenberg F, Carrión F, Tomé L, Larrieux N, Zhang X, Pritsch O, Buschiazzo A. (2015) Conformational plasticity of a native retroviral capsid revealed by X-ray crystallography. Science 349:95-8.

  • Methot SP, Litzler LC, Trajtenberg F, Zahn A, Robert F, Pelletier J, Buschiazzo A, Magor BG, Di Noia JM. (2015) Consecutive interactions with HSP90 and eEF1A underlie a functional maturation and storage pathway of AID in the cytoplasm. J Exp Med. 212:581-96.

  • Trajtenberg F, Albanesi D, Ruétalo N, Botti H, Mechaly AE, Nieves M, Aguilar PS, Cybulski L, Larrieux N, de Mendoza D, Buschiazzo A. (2014) Allosteric activation of bacterial response regulators: the role of the cognate histidine kinase beyond phosphorylation. mBio. 5:e02105.

  • Morero NR, Botti H, Nitta KR, Carrión F, Obal G, Picardeau M, Buschiazzo A. (2014) HemR is an OmpR/PhoB-like response regulator from Leptospira, which simultaneously effects transcriptional activation and repression of key haem metabolism genes. Mol Microbiol. 94:340-52.

  • Horjales S, Schmidt-Arras D, Limardo RR, Leclercq O, Obal G, Prina E, Turjanski AG, Spaeth GF, Buschiazzo A. (2012) The crystal structure of the MAP kinase LmaMPK10 from Leishmania major reveals parasite-specific features and regulatory mechanisms. Structure 20:1649-60.