Cristalografía de Proteínas

>>>Cristalografía de Proteínas

El propósito de la Unidad de Cristalografía de Proteínas es servir de plataforma tecnológica proporcionando equipos, capacitación, asistencia e innovaciones tecnológicas para determinar estructuras tridimensionales de proteínas y otras macromoléculas y ensamblajes macromoleculares.

La cristalografía de rayos X es una de las técnicas más poderosas para estudiar las estructuras tridimensionales de las macromoléculas y ha transformado nuestra comprensión de los procesos biológicos. Esta instalación permite a los usuarios cristalizar macromoléculas y resolver sus estructuras tridimensionales mediante difracción de rayos X.


PhD Alejandro Buschiazzo

Investigador Principal

Lic. Joaquin Dalla Rizza

Técnico

Nicole Larrieux

Técnica, Bioquímica Clínica

PhD Felipe Trajtenberg

Investigador Adjunto
  • Robot de cristalización – Honeybee963®
    El robot Honeybee963® (Digilab) es un sistema de mesada para la automatización y miniaturización de experimentos de cristalización de proteínas usando el método de difusión de vapor en gota sentada. Los dispensadores synQUAD® combinan válvulas micro-solenoides de alta velocidad con bombas y jeringas de alta resolución, dispensando volúmenes de hasta 100nL. Actualmente utilizamos nanogotas de 200-300nL maximizando las probabilidades de cristalización. El brazo de 96 agujas permite el dispensado rápido de las soluciones que se encuentran en el reservorio a placas de 96 pocillos. Tres agujas synQUAD® independientes proceden a dispensar volúmenes de hasta tres proteínas distintas, con volúmenes variables elegidos a través de la programación del robot. La automatización permite ensayar cientos de condiciones potenciales de cristalogénesis en cuestión de minutos, permitiendo aumentar el espacio de rastreo, un requisito necesario para aumentar la probabilidad de éxito.

  • Robot de producción y optimización de cristales – Alchemist DT®
    El Alchemist DT ® (Formulatrix) es un robot de mesada de manejo de líquidos para la producción y optimización de condiciones de cristalización. Los líquidos son dispensados en placas SBS, Linbro® o Nextal® de manera confiable, precisa y exacta en un rango de volúmenes entre 1 μl a 10 ml. Debido a su tecnología, la ausencia de tuberías evita el descarte de desechos y elimina toda contaminación cruzada.
    El programa informático que acompaña el sistema (CrystalTrak™) está diseñado específicamente para cristalografía de proteínas. Una vez que la placa es diseñada, Crystal Trak™ automáticamente calcula la receta y define las soluciones madre necesarias. 26 soluciones madre pueden ser almacenadas simultáneamente en el equipo. Las herramientas para el manejo de estas soluciones y el rastreo por código de barras aseguran que las soluciones madres correctas y los volúmenes necesarios estén disponibles en el equipo antes de que la placa sea generada.

  • Generador de rayos X – MicroMax-007HF®
    El Micromax007-HF® (Rigaku) es un generador de rayos X con una fuente de diámetro focal efectivo de 0.07mm. Equipado con un ánodo de cobre rotatorio, es capaz de generar una salida de 1200 W y un brillo de 31kW/mm2. En combinación con la óptica instalada (Varimax-HF®, Rigaku), que consiste de espejos multicapa confocales, los rayos X enfocados en la muestra cristalina son muy brillantes y pueden utilizarse para tomar medidas con varios propósitos. Podemos resolver estructuras con átomos que dispersan en forma anómala, a la longitud de onda fija de 1.5418Å (como átomos de S, I, Cs, lantánidos, entre los más utilizados). También se pueden resolver estructuras que permitan ser abordadas por reemplazo molecular, y en fin, colectas de datos para el refinamiento de estructuras a alta resolución (por ej. incluyendo ligandos, inhibidores, drogas, variantes de proteínas por mutaciones puntuales, etc).

  • Detector de área de tipo placa de imagen – MAR345®
    El detector MAR345® (Mar Research) instalado en una mesa MAR345dtb® es un detector de área de tipo placa de imagen que nos permite colectar datos hasta 1.2Å de resolución gracias a la configuración geométrica que hemos diseñado (aprovechando al máximo el ángulo 2θ). Esta geometría de oscilación según un único ángulo Φ, se acompaña de un conveniente motor que rota según χ que facilita el montado de cristales en condiciones criogénicas. Los ciclos de lectura van desde 108 a 34 segundos, dependiendo del tamaño de los píxeles y del diámetro de la placa efectivamente escaneada.
    El sistema de lectura del Mar345 es único en el sentido que utiliza un solo láser de 85mW de alta performance, el cual brinda más de 0.8 µJ/pixel en la placa. Esto asegura que un porcentaje extremadamente alto de centros-F atrapados son transformados en luminiscencia fotoestimulada.

Para solicitar servicios y/o acceder a la plataforma, los usuarios deben escribir a pxf@pasteur.edu.uy planteando brevemente la solicitud. En respuesta se les enviará un formulario donde deberán completar información vinculada al objeto del proyecto, especificaciones sobre la macromolécula de interés y otros detalles. Esta información será evaluada por la Unidad según su viabilidad técnica y relevancia científica. Todas las solicitudes tendrán una respuesta en la que se detallará el camino a seguir.
El nivel de apoyo que dará el personal de la Unidad dependerá de la autonomía del usuario. El uso de equipamiento específico (robots de cristalización y optimización, y difracción de rayos X) estará siempre supervisado por personal de la plataforma. Los eventuales costos para cubrir gastos se acordarán con los usuarios de acuerdo con el proyecto y a las preferencias de cada usuario por los distintos ensayos.

Enfoques experimentales disponibles para los usuarios:
1. Pruebas de cristalización de proteínas: manuales y asistidas por robots (Honeybee963®, Isogen Life Science)
2. Seguimiento y optimización de los aciertos iniciales de cristalización: manual y asistido por robot (Alchemist®, Formulatrix)
3. Difracción de rayos X – Prueba y caracterización inicial de cristales
4. Difracción de rayos X – colección de datos de cristal único en nuestro sistema de difracción (de ser pertinente, colecta de datos en el sincrotrón Diamond Light Source, UK, al que tenemos acceso)
5. Determinación y refinamiento de la estructura cristalina

  • Curso “Macromolecular Crystallography: introduction and applications” – 2010 (Institut Pasteur de Montevideo)

  • Escuela “Macromolecular Crystallography School – From data processing to structure refinement and beyond”. Curso co-organizado con CCP4 (UK), aseguramos una periodicidad anual desde el año 2013, año fundacional que fuera realizado en el Institut Pasteur de Montevideo. En años pares (2014, 2016) el curso se realizó en el Instituto de Fisica de Sao Carlos (Univ de Sao Paulo, Sao Carlos, Brasil), y en los impares (2015, 2017) en el Inst Pasteur de Montevideo.

  • Simpkin AJ, Simkovic F, Thomas JMH, Savko M, Lebedev A, Uski V, Ballard C, Wojdyr M, Wu R, Sanishvili R, Xu Y, Lisa MN, Buschiazzo A, Shepard W, Rigden DJ, Keegan RM. (2018) SIMBAD: a sequence-independent molecular-replacement pipeline. Acta Crystallogr D Struct Biol 74:595-605.

  • Alvarez CE, Trajtenberg F, Larrieux N, Saigo M, Golic A, Andreo CS, Hogenhout SA, Mussi MA, Drincovich MF, Buschiazzo A. (2018) The crystal structure of the malic enzyme from Candidatus Phytoplasma reveals the minimal structural determinants for a malic enzyme. Acta Crystallogr D Struct Biol 74:332-40.

  • Morán-Barrio J, Lisa MN, Larrieux N, Drusin SI, Viale AM, Moreno DM, Buschiazzo A, Vila AJ. (2016) Crystal structure of the metallo-β-lactamase GOB in the periplasmic dizinc form reveals an unusual metal site. Antimicrob Αgents Chemother. 60:6013-22.

  • Meyer PA, Socias S, Key J, Ransey E, Tjon EC, Buschiazzo A, et al. (2016) Data publication with the structural biology data grid supports live analysis. Nat Commun. 7:10882.

  • East A, Mechaly AE, Huysmans GHM, Bernarde C, Tello-Manigne D, Nadeau N, Pugsley AP, Buschiazzo A, Alzari PM, Bond PJ, Francetic O. (2016) Structural basis of pullulanase membrane binding and secretion revealed by X-ray crystallography, molecular dynamics and biochemical analysis. Structure. 24:92-104.

  • Trajtenberg F, Altabe S, Larrieux N, Ficarra F, de Mendoza D, Buschiazzo A, Schujman GE. (2014) Structural insights into bacterial resistance to cerulenin. FEBS J. 281:2324-38.

  • Martinez A, Peluffo G, Petruk AA, Hugo M, Piñeyro D, Demicheli V, Moreno DM, Lima A, Batthyány C, Durán R, Robello C, Martí MA, Larrieux N, Buschiazzo A, Trujillo M, Radi R, Piacenza L. (2014) Structural and molecular basis of the peroxynitrite-mediated nitration and inactivation of Trypanosoma cruzi iron-superoxide dismutases (Fe-SODs) A and B: disparate susceptibilities due to the repair of Tyr35 radical by Cys83 in Fe-SODB through intramolecular electron transfer. J Biol Chem. 289(18):12760-78.

  • Correa A, Trajtenberg F, Obal G, Pritsch O, Dighiero G, Oppezzo P, Buschiazzo A. (2013) Structure of a human IgA1 Fab fragment at 1.55 Å resolution: potential effect of the constant domains on antigen-affinity modulation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69:388-97.

  • Buschiazzo A, Muiá R, Larrieux N, Pitcovsky T, Mucci J, Campetella O. (2012) Trypanosoma cruzi trans-sialidase in complex with a neutralizing antibody: structure/function studies towards the rational design of inhibitors. PLoS Pathog. 8:e1002474.