Bioquímica y Proteómica Analíticas

>>>Bioquímica y Proteómica Analíticas

Los objetivos de la Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas —un grupo mixto entre el IP Montevideo y el Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)— son realizar y apoyar proyectos de investigación biomédica basados en espectrometría de masas (EM) y proteómica; ofrecer capacitación, asistencia científica y acceso a tecnologías proteómicas basadas en EM a la comunidad científica local; y contribuir a los programas locales y regionales de educación en esta área.

Durante los últimos años, la Unidad incorporó espectrómetros de masas y desarrolló el know-how para expandir la calidad y el tipo de procedimientos analíticos disponibles. Actualmente, nuestro portafolio analítico incluye estrategias proteómicas cuantitativas y comparativas de tipo “shotgun”, así como estrategias basadas en geles, estudios interactómicos in vivo e in vitro, y análisis de modificaciones postraduccionales de proteínas.

El trabajo de investigación de nuestro grupo se centra en el estudio de los mecanismos de señalización en micobacterias utilizando enfoques proteómicos, con énfasis en el análisis de fosforilación de proteínas. En particular nos interesa comprender algunos procesos claves para las micobacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis, y que están relacionados a su capacidad de sobrevivir dentro del hospedero.


Magdalena Portela

Asistente Técnico

madelon@pasteur.edu.uy


Analía Lima

Asistente Técnico, Estudiante de Doctorado

alima@pasteur.edu.uy


Jessica Rossello

Estudiante de Doctorado

jrossello@pasteur.edu.uy


MSc Bernardina Rivera

Asistente Técnico

brivera@pasteur.edu.uy


Alejandro Leyva

Asistente Técnico, Estudiante de Doctorado

alejandrolp@pasteur.edu.uy

  • Caracterización de procesos regulados por fosforilación de proteínas en Mycobacterium tuberculosis.
    Mycobacterium tuberculosis utiliza la fosforilación de proteínas en residuos hidroxilados para regular procesos vitales. Nuestro trabajo se centra en la caracterización de vías de señalización mediadas por fosforilación en micobacterias. Describimos los mecanismos de regulación de Ser/Thr quinasas e identificamos sus sustratos y blancos “downstream” en las vías de señalización. Utilizando entrecruzamiento in vivo y espectrometría de masa logramos obtener una “instantánea” de las interacciones proteína-proteína en la bacteria. Esto nos ha permitido comenzar a dilucidar interacciones dependientes de fosforilación que participan en la regulación de la asimilación de nitrógeno y la división celular.

  • HPLC analítico, Agilent 1200

  • HPLC capilar, Agilent 1200

  • Nano HPLC, Easy-nLC 1000, Thermo-Proxeon

  • Nano HPLC, UltiMate 3000 Thermo

  • Electroforesis 2D, Sistema de Enfoque Isoeléctrico EttanIPGphor + Equipo para electroforesis EttanDaltSix

  • Escaner de Fluorescencia Typhoon FLA 9500, GE Healthcare

  • Espectrómetro de masa 4800 MALDI TOF/TOF, AbiSciex

  • Espectrómetro de masa LTQ Velos + ETD, Thermo

  • Espectrómetro de masa QExactive Plus (Q-Orbitrap), Thermo

  • Colector de microfracciones para sembrado en placa MALDI, Probot LC-Packing

1- Análisis de rutina
Para análisis de rutina, los usuarios podrán acceder a la UByPA como un “laboratorio con costos por servicio” subvencionado por el Institut Pasteur de Montevideo. La Unidad ofrece este tipo de servicio a investigadores nacionales. Los análisis serán realizados por miembros de nuestro equipo técnico de acuerdo con protocolos estándares y siguiendo procedimientos rutinarios para la interpretación de los datos.
Entre este tipo de análisis se incluyen:

  • Electroforesis bidimensional

  • Preparación de muestras de proteínas para análisis por MS: digestión en gel, digestión en solución, desalado

  • Determinación de masa molecular de péptidos y pequeñas proteínas por MS

  • Identificación de proteínas por MALDI-TOF MS/MS (huella peptídica, MS/MS) y búsqueda en bases de datos

Para realizar un análisis de rutina, escriba al equipo técnico de la Unidad para corroborar disponibilidad al correo ubypa@pasteur.edu.uy. Cuando su solicitud haya sido aceptada, le solicitaremos el envío del formulario correspondiente a la misma casilla para agendar el análisis.
Los formularios son:

Los trabajos en colaboración con la Unidad son siempre bienvenidos. En este caso, los miembros de la Unidad se involucrarán en las distintas etapas del proyecto, incluyendo la concepción y diseño de experimentos y protocolos a medida, el aporte de ideas originales, y el análisis e interpretación de datos más allá de los análisis de rutina.
Entre los análisis no rutinarios se encuentran:

  • Preparación de muestras a medida

  • Proteómica de tipo “shotgun”

  • Proteómica basada en electroforesis bidimensional

  • Proteómica comparativa

  • Análisis de Interactomas

  • Análisis de modificaciones postraduccionales

  • Secuenciación de péptidos de novo

Por consultas científicas, por favor escríbanos a ubypa@pasteur.edu.uy. Buscaremos tener gran flexibilidad para acordar, caso por caso, la mejor manera de usar nuestras instalaciones.

  • ICGEB & UNU-BIOLAC “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”; 15 al 23 de Octubre de 2018. Organizadores: Rosario Durán, Paulo Carvalho & Carlos Batthyány.

  • UNU-BIOLAC & PEDECIBA “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”;.28 de noviembre al 2 de diciembre, 2016. Organizadores: Rosario Durán, Paulo Carvalho & Carlos Batthyány.

  • UNU-BIOLAC & RIIP (Institut Pasteur International Network) “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”. 1 a 12 de setiembre, 2014. Organizadores: Rosario Durán & Carlos Batthyány.

  • UNU-Biolac- “Mass Spectrometry (MS) in Proteomics” Institut Pasteur de Montevideo. Del 26 de Noviembre al 8 Diciembre de 2012. Organizadores: C. Batthyany, R. Durán

  • EMBO World Practical Course. “Mass Spectrometry in Protein Analysis and Characterization”, EMBO, IPMONT, ANII; Montevideo, Uruguay. 16 al 26 de Marzo de 2010. Organizadores: C. Cerveñansky, R. Durán & C. Batthyany

  • “Workshop on mass spectrometry and it’s application on protein analysis”, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Faculdade de CiênciasFarmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de, São Paulo, Brasil. Del 19 al 24 de Octubre de 2009. Organizadores: R. Durán & C. Batthyany.

  • Curso: “Integrating IP Montevideo technologies” Módulo: Caracterización de proteínas usando Espectrometría de masa. 6 de octubre de 2017. Organizadores del módulo: A. Lima y M. Portela.

  • 2018-2022 – Molecular mechanisms of phospho-dependent regulation and assembly of the bacterial divisome. ANR Francia. Coordinador P. Alzari, Institut Pasteur, Paris

  • 2015-2018 – Redes de señalización mediadas por dominios FHA en micobacterias y su rol en la adaptación al ambiente del hospedero. Responsable:Rosario Durán.Fondo Clemente Estable, Modalidad I. FCE_1_2014_1_104045.

  • 2012-2014 – Exploring the role of mosquito’s saliva in the transmission of Rift Valley fever; Actions Concertées Interpasteuriennes (ACIP). Coordinador: V. CHOUMET (Paris). Responsables en Uruguay: C. Batthyány & R. Durán.

  • 2014-2016 – Análisis proteómico comparativo de dos cepas de P. aeruginosa con distinta capacidad de adhesión a células epiteliales. Tesista Responsable: J. Rossello Fondo Clemente Estable, Modalidad II. FCE_3_2013_1_100344.

  • 2014-2016 – Hacia la elucidación del mecanismo molecular utilizado por PknG para ejercer su rol como factor de virulencia Tesista Responsable: M. Gil Fondo Clemente Estable, Modalidad II. FCE_3_2013_1_100358.

  • Piñas GE, Reinoso-Vizcaino NM, Yandar Barahona NY, Cortes PR, Duran R, Badapanda C, Rathore A, Bichara DR, Cian MB, Olivero NB, Perez DR, Echenique J. 2018. Crosstalk between the serine/threonine kinase StkP and the response regulator ComE controls the stress response and intracellular survival of Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathog. 14(6):e1007118

  • Fló M., Margenat M., Pellizza L., Graña M., Durán R., Báez A., Salceda E., Soto E., Alvarez B., Fernández C. 2017. Functional diversity of secreted cestodeKunitz proteins: Inhibition of serine peptidases and blockade of cation channels. PLoSPathogens. 13(2):e1006169

  • Prieto D., Sotelo N., Seija N., Sernbo S., Abreu C., Durán R., Gil M., Sicco E., Irigoin V., Oliver C., Landoni A.I., Gabus R., Dighiero G., Oppezzo P. 2017. S100-A9 protein in exosomes from chronic lymphocytic leukemia cells promotes NF-κB activity during disease progression. Blood. 130(6):777-788

  • Silva A.R.F., Lima D.B., Leyva A., Duran R., Batthyany C., Aquino P.F., Leal J.C., Rodriguez J.E., Domont G.B., Santos M.D.M., Chamot-Rooke J., Barbosa V.C., Carvalho P.C. 2017 DiagnoProt: a tool for discovery of new molecules by mass spectrometry. Bioinformatics. 33(12):1883-1885. doi: 10.1093/bioinformatics/btx093

  • Silva A.R.F., Lima D.B., Leyva A., Duran R., Batthyany C., Aquino P.F., Leal J.C., Rodriguez J.E., Domont G.B., Santos M.D.M., Chamot-Rooke J., Barbosa V.C., Carvalho P.C. 2017 DiagnoProt: a tool for discovery of new molecules by mass spectrometry. Bioinformatics. 33(12):1883-1885. doi: 10.1093/bioinformatics/btx093

  • Cabrera G., Lundberg U., Rodríguez-Ulloa A., Herrera M., Machado W., Portela M., Palomares S., Espinosa L.A., Ramos Y., Durán R., Besada V., Vonasek E., González L.J. 2017 Protein content of the Hylesiametabus egg nest setae (Cramer [1775]) (Lepidoptera: Saturniidae) and its association with the parental investment for the reproductive success and lepidopterism. J Proteomics. 150:183-200

  • Folle A.M., Kitano E.S., Lima A., Gil M., Cucher M.; Mourglia-Ettlin G., Iwai L.K., Rosenzvit M., Battyány C., Ferreira A.M. Characterisation of Antigen B protein species present in the hydatid cyst fluid of Echinococcuscanadensis G7 genotype. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2017.

  • Rossello J., Lima A., Gil M., Duarte J.R., Correa A., Carvalho P.C., Kierbel A., Durán R. 2017. The EAL-domain protein FcsR regulates flagella, chemotaxis and type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa by a phosphodiesterase independent mechanism. ScientificReports. 7(1): 10281.

  • Gil M, Graña M, Schopfer FJ, Wagner T, Denicola A, Freeman BA, Alzari PM, Batthyány C, Durán R. Inhibition of Mycobacterium tuberculosis PknG by non-catalytic rubredoxin domain specific modification: reaction of an electrophilic nitro-fatty acid with the Fe-S center. Free Radic. Biol. Med. 65, 150–161 (2013).

  • O’Hare, H; Durán, R; Cerveñansky,C, Bellinzoni, M.; Wehenkel, A.; Pritsch, O.; Obal, G; Baumgartner, J; Johnsson,K; Alzari, PM. Regulation of glutamate metabolism by proteinkinases in mycobacteria. Molecular Microbiology 70, 1408-1423 (2008).

  • Durán, R., Villarino, A., Bellinzoni, M., Wehenkel, A., Fernandez, P., Boitel, B., Cole, S.T., Alzari, P.M., Cervenansky, C. Conserved autophosphorylation pattern in activation loops and juxtamembrane regions of Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr protein kinases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333:858-67 (2005).

  • Villarino*, A., Durán*, R., Wehenkel, A., Fernandez, P., England, P., Brodin, P., Cole, S.T., Zimny-Arndt, U., Jungblut, P.R., Cervenansky, C., Alzari, P.M. Proteomic identification of M. tuberculosis protein kinase substrates: PknB recruits GarA, a FHA domain-containing protein, through activation loop-mediated interactions. J. Mol. Biol. 350:953-63 (2005). * These authors have equally contributed to the work.