Bioquímica y Proteómica Analíticas

>>>Bioquímica y Proteómica Analíticas

Los objetivos de la Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas —un grupo mixto entre el IP Montevideo y el Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)— son realizar y apoyar proyectos de investigación biomédica basados en espectrometría de masas (EM) y proteómica; ofrecer capacitación, asistencia científica y acceso a tecnologías proteómicas basadas en EM a la comunidad científica local; y contribuir a los programas locales y regionales de educación en esta área.

Durante los últimos años, la Unidad incorporó espectrómetros de masas y desarrolló el know-how para expandir la calidad y el tipo de procedimientos analíticos disponibles. Actualmente, nuestro portafolio analítico incluye estrategias proteómicas cuantitativas y comparativas de tipo “shotgun”, así como estrategias basadas en geles, estudios interactómicos in vivo e in vitro, y análisis de modificaciones postraduccionales de proteínas.

El trabajo de investigación de nuestro grupo se centra en el estudio de los mecanismos de señalización en micobacterias utilizando enfoques proteómicos, con énfasis en el análisis de fosforilación de proteínas. En particular nos interesa comprender algunos procesos claves para las micobacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis, y que están relacionados a su capacidad de sobrevivir dentro del hospedero.

Lic. Magdalena Portela
Asistente técnica
madelon@pasteur.edu.uy
Analía Lima, PhD
Asistente técnica
alima@pasteur.edu.uy
 Jessica Rossello, MSc
Ayudante técnica
Estudiante de doctorado
jrossello@pasteur.edu.uy
Bernardina Rivera, MSc
Asistente técnica
brivera@pasteur.edu.uy
Lic. Alejandro Leyva
Asistente técnico
Estudiante de doctorado
alejandrolp@pasteur.edu.uy
Paulo Carvalho, PhD
Investigador asociado honorario
……………………………………………………..
Azalia Rodríguez, MSc
Estudiante de doctorado
arodriguez@pasteur.edu.uy
Flavio Pazos Obregón, PhD
Asistente técnico
flavio.pazos@gmail.com
  • Caracterización de procesos regulados por fosforilación de proteínas en Mycobacterium tuberculosis.
    Mycobacterium tuberculosis utiliza la fosforilación de proteínas en residuos hidroxilados para regular procesos vitales. Nuestro trabajo se centra en la caracterización de vías de señalización mediadas por fosforilación en micobacterias. Describimos los mecanismos de regulación de Ser/Thr quinasas e identificamos sus sustratos y blancos “downstream” en las vías de señalización. Utilizando entrecruzamiento in vivo y espectrometría de masa logramos obtener una “instantánea” de las interacciones proteína-proteína en la bacteria. Esto nos ha permitido comenzar a dilucidar interacciones dependientes de fosforilación que participan en la regulación de la asimilación de nitrógeno y la división celular.

  • HPLC analítico, Agilent 1200

  • HPLC capilar, Agilent 1200

  • Nano HPLC, Easy-nLC 1000, Thermo-Proxeon

  • Nano HPLC, UltiMate 3000 Thermo

  • Electroforesis 2D, Sistema de Enfoque Isoeléctrico EttanIPGphor + Equipo para electroforesis EttanDaltSix

  • Escaner de Fluorescencia Typhoon FLA 9500, GE Healthcare

  • Espectrómetro de masa 4800 MALDI TOF/TOF, AbiSciex

  • Espectrómetro de masa LTQ Velos + ETD, Thermo

  • Espectrómetro de masa QExactive Plus (Q-Orbitrap), Thermo

  • Colector de microfracciones para sembrado en placa MALDI, Probot LC-Packing

1- Análisis de rutina
Para análisis de rutina, los usuarios podrán acceder a la UByPA como un “laboratorio con costos por servicio” subvencionado por el Institut Pasteur de Montevideo. La Unidad ofrece este tipo de servicio a investigadores nacionales. Los análisis serán realizados por miembros de nuestro equipo técnico de acuerdo con protocolos estándares y siguiendo procedimientos rutinarios para la interpretación de los datos.
Entre este tipo de análisis se incluyen:

  • Electroforesis bidimensional

  • Preparación de muestras de proteínas para análisis por MS: digestión en gel, digestión en solución, desalado

  • Determinación de masa molecular de péptidos y pequeñas proteínas por MS

  • Identificación de proteínas por MALDI-TOF MS/MS (huella peptídica, MS/MS) y búsqueda en bases de datos

Para realizar un análisis de rutina, escriba al equipo técnico de la Unidad para corroborar disponibilidad al correo ubypa@pasteur.edu.uy. Cuando su solicitud haya sido aceptada, le solicitaremos el envío del formulario correspondiente a la misma casilla para agendar el análisis.
Los formularios son:

Los trabajos en colaboración con la Unidad son siempre bienvenidos. En este caso, los miembros de la Unidad se involucrarán en las distintas etapas del proyecto, incluyendo la concepción y diseño de experimentos y protocolos a medida, el aporte de ideas originales, y el análisis e interpretación de datos más allá de los análisis de rutina.
Entre los análisis no rutinarios se encuentran:

  • Preparación de muestras a medida

  • Proteómica de tipo “shotgun”

  • Proteómica basada en electroforesis bidimensional

  • Proteómica comparativa

  • Análisis de Interactomas

  • Análisis de modificaciones postraduccionales

  • Secuenciación de péptidos de novo

Por consultas científicas, por favor escríbanos a ubypa@pasteur.edu.uy. Buscaremos tener gran flexibilidad para acordar, caso por caso, la mejor manera de usar nuestras instalaciones.

  • ICGEB & UNU-BIOLAC “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”; 15 al 23 de Octubre de 2018. Organizadores: Rosario Durán, Paulo Carvalho & Carlos Batthyány.

  • UNU-BIOLAC & PEDECIBA “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”;.28 de noviembre al 2 de diciembre, 2016. Organizadores: Rosario Durán, Paulo Carvalho & Carlos Batthyány.

  • UNU-BIOLAC & RIIP (Institut Pasteur International Network) “Proteome Analysis by Mass Spectrometry”. 1 a 12 de setiembre, 2014. Organizadores: Rosario Durán & Carlos Batthyány.

  • UNU-Biolac- “Mass Spectrometry (MS) in Proteomics” Institut Pasteur de Montevideo. Del 26 de Noviembre al 8 Diciembre de 2012. Organizadores: C. Batthyany, R. Durán

  • EMBO World Practical Course. “Mass Spectrometry in Protein Analysis and Characterization”, EMBO, IPMONT, ANII; Montevideo, Uruguay. 16 al 26 de Marzo de 2010. Organizadores: C. Cerveñansky, R. Durán & C. Batthyany

  • “Workshop on mass spectrometry and it’s application on protein analysis”, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Faculdade de CiênciasFarmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de, São Paulo, Brasil. Del 19 al 24 de Octubre de 2009. Organizadores: R. Durán & C. Batthyany.

  • Curso: “Integrating IP Montevideo technologies» Módulo: Caracterización de proteínas usando Espectrometría de masa. 6 de octubre de 2017. Organizadores del módulo: A. Lima y M. Portela.

  • 2018-2022 – Molecular mechanisms of phospho-dependent regulation and assembly of the bacterial divisome. ANR Francia. Coordinador P. Alzari, Institut Pasteur, Paris

  • 2015-2018 – Redes de señalización mediadas por dominios FHA en micobacterias y su rol en la adaptación al ambiente del hospedero. Responsable:Rosario Durán.Fondo Clemente Estable, Modalidad I. FCE_1_2014_1_104045.

  • 2012-2014 – Exploring the role of mosquito’s saliva in the transmission of Rift Valley fever; Actions Concertées Interpasteuriennes (ACIP). Coordinador: V. CHOUMET (Paris). Responsables en Uruguay: C. Batthyány & R. Durán.

  • 2014-2016 – Análisis proteómico comparativo de dos cepas de P. aeruginosa con distinta capacidad de adhesión a células epiteliales. Tesista Responsable: J. Rossello Fondo Clemente Estable, Modalidad II. FCE_3_2013_1_100344.

  • 2014-2016 – Hacia la elucidación del mecanismo molecular utilizado por PknG para ejercer su rol como factor de virulencia Tesista Responsable: M. Gil Fondo Clemente Estable, Modalidad II. FCE_3_2013_1_100358.

  • Lima A, Leyva A, Rivera B, Portela MM, Gil M, Cascioferro A, Lisa MN, Wehenkel A, Bellinzoni M, Carvalho PC, Batthyány C, Alvarez MN, Brosch R, Alzari PM, Durán R. (2021) Proteome remodeling in the Mycobacterium tuberculosis PknG knockout: Molecular evidence for the role of this kinase in cell envelope biogenesis and hypoxia response. Journal of Proteomics. 244, 104276 DOI: 10.1016/j.jprot.2021.104276

  • Lisa MN, Sogues A, Barilone N, BaumgartM3, Gil M, Graña M, Durán R, Biondi RM, Bellinzoni M, Bott M, Alzari PM (2021) A Tetratricopeptide Repeat Scaffold Couples Signal Detection to OdhI Phosphorylation in Metabolic Control by the Protein Kinase PknG. mBio e0171721. doi: 10.1128/mBio.01717-21.

  • Martinez-Sanguiné AY, D’Alessandro B, Langleib M, Traglia GM, Mónaco A, Durán R, Chabalgoity JA, Betancor L, Yim L. (2021) Salmonella enteric Serovars Dublin and Enteritidis Comparative Proteomics Reveals Differential Expression of Proteins Involved in Stress Resistance, Virulence, and Anaerobic Metabolism. Infect Immun. 16, 89(3). doi: 10.1128/IAI.00606-20.

  • Ott C, Tomasina F, Campolo N, Bartesaghi S, Mastrogiovanni M, Leyva A, Batthyany C, Meinl W, Grune T, Radi R. (2021) Decreased proteasomal cleavage at nitrotyrosine sites in proteins and peptides. Redox Biology. 46, 102106 DOI: 10.1016/j.redox.2021.102106

  • González LJ, Encinosa Guzmán PE, Machado W, Pousa S, Leyva A, Cano Arguelles AL, Cabrera G, Espinosa LA, Parra R, Hernández R, Bello Soto Y, Ledesma FL, Joglar M, Guirola O, Ulrich Kurt L, Carvalho PC, Cabrales A, Garay H, Besada V, Durán R, Takao T, Estrada MP, Rodríguez-Mallon A. (2021). Synthesis, LC-MS/MS analysis, and biological evaluation of two vaccine candidates against ticks based on the antigenic P0 peptide from R. sanguineus linked to the p64K carrier protein from Neisseria meningitidis. Anal Bioanal Chem. 413, 5885–5900 DOI: 10.1007/s00216-021-03569-0

  • Cardozo V, Vaamonde L, Parodi-Talice A, Zuluaga MJ, Agrati D, Portela M, Lima A, Blasina F, Dajas F, Bedó G. (2021) Multitarget neuroprotection by quercetin: Changes in gene expression in two perinatal asphyxia models. Neurochem Int. 147:105064. doi: 10.1016/j.neuint.2021.105064.

  • Chalar C, Clivio G, Montagne J, Costábile A, Lima A, Papa NG, Berois N, Arezo MJ. (2021) Embryonic developmental arrest in the annual killifish Austrolebias charrua: A proteomic approach to diapause III..PLoS One. 16(6):e0251820. doi: 10.1371/journal.pone.0251820.

  • Demicheli V, Tomasina F, Sastre S, Zeida A, Tórtora V, Lima A, Batthyány C, Radi R. (2021) Cardiolipin interactions with cytochrome c increase tyrosine nitration yields and site-specificity. Arch Biochem Biophys. 703:108824. doi: 10.1016/j.abb.2021.108824.

  • Rivera B, Leyva A, Portela MM, Moratorio G, Moreno P, Durán R, Lima A. (2020) Quantitative proteomic dataset from oro- and naso-pharyngeal swabs used for COVID-19 diagnosis: Detection of viral proteins and host’s biological processes altered by the infection. Data in Brief. 32, 106121 DOI: 10.1016/j.dib.2020.106121

  • Sogues A, Martinez M, Gaday Q, Ben Assaya M, Graña M, Voegele A, VanNieuwenhze M, England P, Haouz A, Chenal A, Trépout S, Duran R, Wehenkel AM, Alzari PM. (2020) Essential dynamic interdependence of FtsZ and SepF for Z-ring and septum formation in Corynebacterium glutamicum Nature Communications 11, 1641 doi:10.1038/s41467-020-15490-8.

  • Rodríguez Mallón A, Javier González L, Encinosa Guzmán PE, Bechara GH, Sanches GS, Pousa S, Cabrera G, Cabrales A, Garay H, Mejías R, López Álvarez JR, Bello Soto Y, Almeida F, Guirola O, Rodríguez Fernández R, Fuentes Castillo A, Méndez L, Jiménez S, Licea-Navarro A, Portela M, Durán R, Estrada MP (2020) Functional and Mass Spectrometric Evaluation of an Anti-Tick Antigen Based on the P0 Peptide Conjugated to Bm86 Protein. Pathogens 25;9(6):513. doi:10.3390/pathogens9060513.

  • Bei J, Bigi MM, Lima A, Zhang Q, Blanco FC, Lopez B, Yu T, Wang Z, Dai Z,Chen Z, Cataldi AA, Sasiani MC, Ritacco V, de la Barrera S, Soria MA, Durán R, Bigi F. (2020) A Phenotypic characterization of two isolates of a multidrug-resistant outbreak strain of Mycobacterium tuberculosis with opposite epidemiological fitness. Biomed Res Int. 8; 2020:4741237. 6doi: 10.1155/2020/4741237.

  • Forrellad MA, Blanco FC, Marrero Diaz De Villegas R, Vázquez CL, Yaneff A, García EA, Gutierrez M, Durán R, Villarino A, Bigi F. (2020). Rv2577 of Mycobacterium tuberculosis is a virulence factor with dual phosphatase and phosphodiesterase functions.  Front. Microbiol. 11:570794. doi: 10.3389/fmicb.2020.570794.

  • Carreño M, Bresque M, Machado M, Santos L, Durán R, Vitturi DA Escande C, Denicola A (2020). Nitro-fatty acids as activators of hSIRT6 deacetylase activity. Journal of Biological Chemistry 295, 18355 doi:10.1074/jbc.RA120.014883.

  • Colman L, Caggiani M, Leyva A, Bresque M, Liechocki S, Maya-Monteiro CM, Mazal D, Batthyany C, Calliari A, Contreras P, Escande C. (2020) The protein Deleted in Breast Cancer-1 (DBC1) regulates vascular response and formation of aortic dissection during Angiotensin II infusion. Sci Rep. 10, 6772 DOI: 10.1038/s41598-020-63841-8.

  • Mosquillo MF, Smircich P, Lima A, Gehrke SA, Scalese G, Machado I, Gambino D, Garat B, Pérez-Díaz L. (2020) High Throughput Approaches to Unravel the Mechanism of Action of a New Vanadium-Based Compound against Trypanosoma cruzi. Bioinorg Chem Appl. 11:1634270. doi: 10.1155/2020/1634270.

  • Mosquillo MF, Smircich P, Ciganda M, Lima A, Gambino D, Garat B, Pérez-Díaz L. (2020) Comparative high-throughput analysis of the Trypanosoma cruzi response to organometallic compounds. Metallomics. 27;12(5):813-828. doi: 10.1039/d0mt00030b.

  • Tucci P, Portela M, Rivas Chetto C, González-Sapienza G, Marín M.(2020). Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. Plos One 15(3):e0221837. doi: 10.1371/journal.pone.0221837. eCollection 2020

  • Gil M, Lima A, Rivera B, Rossello J, Urdániz E, Cascioferro A, Carrión F, Wehenkel A, Bellinzoni M, Batthyány C, Pritsch O, Denicola A, Alvarez MN, Carvalho PC, Lisa MN, Brosch R, Piuri M, Alzari PM, Durán R. (2019) New substrates and interactors of the mycobacterial Serine/Threonine protein kinase PknG identified by a tailored interactomic approach. (2019) J Proteomics. 192, 321-333. doi: 10.1016/j.jprot.2018.09.013.

  • Bellinzoni M, Wehenkel AM, Durán R, Alzari PM. (2019) Novel mechanistic insights into physiological signaling pathways mediated by mycobacterial Ser/Thr protein kinases. Microbes Infect. 21(5-6):222-229. doi: 10.1016/j.micinf.2019.06.015. Review.

  • Santos L, Colman L, Contreras P, Chini CC, Carlomagno A, Leyva A, Bresque M, Marmisolle I, Quijano C, Durán R, Irigoín F, Prieto-Echagüe V, Vendelbo MH, Sotelo-Silveira JR, Chini EN, Badano JL, Calliari AJ, Escande C. (2019) A novel form of Deleted in breast cancer 1 (DBC1) lacking the N-terminal domain does not bind SIRT1 and is dynamically regulated in vivo. Sci Rep. 9, 14381 DOI: 10.1038/s41598-019-50789-7.

  • Miles S, Portela M, Cyrklaff M, Ancarola ME, Frischknecht F, Durán R, Dematteis S, Mourglia‐Ettlin G (2019) Combining proteomics and bioinformatics to explore novel tegumental antigens as vaccine candidates against Echinococcus granulosus infection. J Cell Biochem. 120(9),15320-15336.  doi: 10.1002/jcb.28799.

  • Spinelli R, Sanchis I, Aimaretti FM, Attademo AM, Portela M, Humpola MV, Tonarelli GG, Siano AS. (2019) Natural Multi-Target Inhibitors of Cholinesterases and Monoamine Oxidase Enzymes with Antioxidant Potential from Skin Extracts of Hypsiboas cordobae and Pseudis minuta (Anura: Hylidae). ChemBiodivers 16(1):e1800472. doi:10.1002/cbdv.201800472.

  • Chavarría C, Trostchansky A, Durán R, Rubbo H, Souza JM. (2019) Nitroalkylation of α-Synuclein by Nitro-Oleic Acid: Implications for Parkinson’s Disease. AdvExp Med Biol. 2019; 1127:169-179. doi: 10.1007/978-3-030-11488-6_11. Review.

  • Ramos-Artuso F, Galatro A, Lima A, Batthyány C, Simontacchi M. (2019) Early events following phosphorus restriction involve changes in proteome and affects nitric oxide metabolism in soybean leaves. Environ Exp Bot. 161:203-2017. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2019.01.002.

  • Piñas GE, Reinoso-Vizcaino NM, Yandar Barahona NY, Cortes PR, Duran R, Badapanda C, Rathore A, Bichara DR, Cian MB, Olivero NB, Perez DR, Echenique J. 2018. Crosstalk between the serine/threonine kinase StkP and the response regulator ComE controls the stress response and intracellular survival of Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathog. 14(6):e1007118

  • Fló M., Margenat M., Pellizza L., Graña M., Durán R., Báez A., Salceda E., Soto E., Alvarez B., Fernández C. 2017. Functional diversity of secreted cestodeKunitz proteins: Inhibition of serine peptidases and blockade of cation channels. PLoSPathogens. 13(2):e1006169

  • Prieto D., Sotelo N., Seija N., Sernbo S., Abreu C., Durán R., Gil M., Sicco E., Irigoin V., Oliver C., Landoni A.I., Gabus R., Dighiero G., Oppezzo P. 2017. S100-A9 protein in exosomes from chronic lymphocytic leukemia cells promotes NF-κB activity during disease progression. Blood. 130(6):777-788

  • Silva A.R.F., Lima D.B., Leyva A., Duran R., Batthyany C., Aquino P.F., Leal J.C., Rodriguez J.E., Domont G.B., Santos M.D.M., Chamot-Rooke J., Barbosa V.C., Carvalho P.C. 2017 DiagnoProt: a tool for discovery of new molecules by mass spectrometry. Bioinformatics. 33(12):1883-1885. doi: 10.1093/bioinformatics/btx093

  • Silva A.R.F., Lima D.B., Leyva A., Duran R., Batthyany C., Aquino P.F., Leal J.C., Rodriguez J.E., Domont G.B., Santos M.D.M., Chamot-Rooke J., Barbosa V.C., Carvalho P.C. 2017 DiagnoProt: a tool for discovery of new molecules by mass spectrometry. Bioinformatics. 33(12):1883-1885. doi: 10.1093/bioinformatics/btx093

  • Cabrera G., Lundberg U., Rodríguez-Ulloa A., Herrera M., Machado W., Portela M., Palomares S., Espinosa L.A., Ramos Y., Durán R., Besada V., Vonasek E., González L.J. 2017 Protein content of the Hylesiametabus egg nest setae (Cramer [1775]) (Lepidoptera: Saturniidae) and its association with the parental investment for the reproductive success and lepidopterism. J Proteomics. 150:183-200

  • Folle A.M., Kitano E.S., Lima A., Gil M., Cucher M.; Mourglia-Ettlin G., Iwai L.K., Rosenzvit M., Battyány C., Ferreira A.M. Characterisation of Antigen B protein species present in the hydatid cyst fluid of Echinococcuscanadensis G7 genotype. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2017.

  • Rossello J., Lima A., Gil M., Duarte J.R., Correa A., Carvalho P.C., Kierbel A., Durán R. 2017. The EAL-domain protein FcsR regulates flagella, chemotaxis and type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa by a phosphodiesterase independent mechanism. ScientificReports. 7(1): 10281.

  • Gil M, Graña M, Schopfer FJ, Wagner T, Denicola A, Freeman BA, Alzari PM, Batthyány C, Durán R. Inhibition of Mycobacterium tuberculosis PknG by non-catalytic rubredoxin domain specific modification: reaction of an electrophilic nitro-fatty acid with the Fe-S center. Free Radic. Biol. Med. 65, 150–161 (2013).

  • O’Hare, H; Durán, R; Cerveñansky,C, Bellinzoni, M.; Wehenkel, A.; Pritsch, O.; Obal, G; Baumgartner, J; Johnsson,K; Alzari, PM. Regulation of glutamate metabolism by proteinkinases in mycobacteria. Molecular Microbiology 70, 1408-1423 (2008).

  • Durán, R., Villarino, A., Bellinzoni, M., Wehenkel, A., Fernandez, P., Boitel, B., Cole, S.T., Alzari, P.M., Cervenansky, C. Conserved autophosphorylation pattern in activation loops and juxtamembrane regions of Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr protein kinases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333:858-67 (2005).

  • Villarino*, A., Durán*, R., Wehenkel, A., Fernandez, P., England, P., Brodin, P., Cole, S.T., Zimny-Arndt, U., Jungblut, P.R., Cervenansky, C., Alzari, P.M. Proteomic identification of M. tuberculosis protein kinase substrates: PknB recruits GarA, a FHA domain-containing protein, through activation loop-mediated interactions. J. Mol. Biol. 350:953-63 (2005). * These authors have equally contributed to the work.