Inmunovirología

Líneas de investigación

Caracterización biofísica y estructural de la proteína de cápside de VLB (CA-VLB).
El mecanismo de formación de la cápside de VLB a través del autoensamblaje de miles de copias de CA-VLB representa un evento clave en el ciclo de este retrovirus. Para comprender este mecanismo hemos caracterizado las propiedades bioquímicas y biofísicas que afectan este proceso y en colaboración con el Laboratorio de Microbiología Molecular y Estructural del IPM elucidamos la estructura tridimensional de CA-VLB, mostrando que se organiza en forma pseudohexagonal con una importante plasticidad conformacional. Por otro lado, generamos nanoanticuerpos dirigidos contra la cápside viral y estudiamos el efecto de la interacción con cápside en la modulación del autoensamblado.

Caracterización de las interacciones entre la CA-VLB y componentes intracelulares de la célula huésped.
El tránsito de la cápside viral entre la membrana plasmática y el núcleo celular depende de la interacción con diversas proteínas celulares. En otros modelos retrovirales se han descripto factores de restricción que perturban la conformación de la cápside generando condiciones anti-virales. Para el caso de los delta-retrovirus como el VLB no tenemos evidencias confirmadas sobre estos mecanismos. En el modelo VIH se ha demostrado que la interacción entre cápside y nucleoporinas participaría en este tránsito y la entrada al núcleo a través del poro nuclear. En función de la capacidad de CA-VLB de autoensamblar in vitro en estructuras supramacromoleculares tubulares o planas, y mediante el uso de técnicas de ologías de espectrometría de afinidad y masa, nuestro objetivo es identificar y caracterizar las interacciones entre BLV CA y los factores del huésped celular involucrados en este tráfico. También buscaremos socios de BLV CA que puedan actuar como sensores inmunes innatos al analizar los lisados celulares de las células permisivas y no permisivas a la infección BLV. Las células de ingeniería generadas por Francesca Di Nunzio en IP Paris, se utilizarán para identificar nuevos factores de restricción o socios virales funcionales mediante espectrometría de masas. También diseñaremos y purificaremos nanoanticuerpos contra BLV CA que serán etiquetados como enfoques de microscopía. Los resultados obtenidos en BLV se transferirán luego a la investigación de HTLV-1 para definir mecanismos comunes y diversos adoptados por estos retrovirus delta al establecer la infección viral.

Caracterización bioquímica, estructural e inmunológica de la proteína de la envoltura BLV.
El complejo de env de BLV tiene un papel crucial en la determinación de la infectividad viral, y es responsable de inducir la fusión de las membranas virales y celulares después del reconocimiento de los receptores específicos de la superficie celular.
Hemos optimizado la expresión del ectodominio de env soluble en células S2 de Drosophila, con un sitio de escisión de furina natural y alterado. La expresión de proteínas y la secreción en el sobrenadante se indujeron mediante metales divalentes, y la purificación de proteínas se realizó por cromatografía de afinidad usando una columna de StrepTactin seguida por cromatografía de exclusión por tamaño. El control de calidad de las proteínas se evaluó mediante espectrometría de masas. Este sistema debería permitir la producción de material suficiente para ensayos de cristalización, crio-microscopía electrónica de trímeros aislados y estudios biofísicos del complejo multimérico formado por las proteínas recombinantes.
Env es uno de los objetivos principales de las respuestas inmunitarias antivirales, que genera tanto anticuerpos neutralizantes humorales como inmunidad adaptativa específica de células T. Se ha informado para otros retrovirus que la presencia de un péptido inmunosupresor (isu) en la estructura de la glicoproteína Env podría ser importante en su capacidad para inmunomodular las respuestas inmunes. Estamos interesados en estudiar el efecto de las modificaciones de aminoácidos en el dominio isu en las respuestas de adaptación humoral y celular frente al desafío con glicoproteínas de Env modificadas. Esto nos permitirá comprender uno de los mecanismos implicados en la generación de resistencia utilizada por BLV para escapar de la respuesta inmune antiviral. Por otro lado, también esperamos identificar las modificaciones que reducen la actividad inmunosupresora de este dominio y, por lo tanto, aumentan su inmunogenicidad. Este resultado podría ser útil para el diseño racional de vacunas efectivas contra este retrovirus.
Mediante el uso de proteína purificada BLV Env también hemos desarrollado una nueva prueba ELISA para usar en el diagnóstico de la leucosis bovina enzoótica. En colaboración con ATGen ahora estamos generando un nuevo kit de diagnóstico EBL que se utilizará en un experimento de campo con más de 50.000 vacas lecheras.

La identificación de características genéticas se asocia con el control natural de EBL.
Dada la alta prevalencia de EBL en Uruguay, la estrategia para erradicar la enfermedad implementada en Europa y Oceanía es impracticable en nuestro país. Una estrategia de control alternativa mediante el uso de vacunas es prometedora, pero todavía no existen productos efectivos en el mercado. Teniendo en cuenta que los resultados recientes muestran que la EBL tiene un componente hereditario que alcanza 8%, una tercera estrategia para controlar la enfermedad involucraría la cría de rebaños al aumentar la frecuencia de genotipos asociados con la resistencia a la infección.
Hemos analizado en un hato experimental con alta prevalencia de infección por BLV, un grupo de animales definidos como «controladores» de la enfermedad y caracterizados por una baja carga proviral y bajos títulos de anticuerpos anti-BLV. Otros grupos se definieron como «no controladores» con alta carga proviral y altos títulos de anticuerpos específicos, y «negativos» sin presencia detectable de BLV.
Mediante el uso de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de estos animales, estamos caracterizando, en colaboración con Natalia Rego y Hugo Naya de la Unidad de Bioinformática IPMON, los representantes transcriptómicos de estos grupos por secuenciación masiva de ARNm (ARNseq). Esperamos identificar genes e isoformas expresados diferencialmente en animales «controladores» e interpretar estas diferencias en el contexto de procesos biológicos, ontologías de vías metabólicas sub o sobrerrepresentadas.