Inmunovirología
El Laboratorio de Inmunovirología estudia los procesos celulares y moleculares involucrados en la transformación leucémica por virus oncogénicos. En particular trabajamos con el modelo de la Leucemia Bovina Enzoótica (LBE) causada por el Virus de la Leucemia Bovina (VLB), que presenta una alta prevalencia en el ganado lechero generando importantes pérdidas económicas para nuestro país.
Con el objetivo de dilucidar los mecanismos que participan en la infección viral hemos analizado la variabilidad genética de VLB en Uruguay comparando sus genotipos circulantes con los descriptos en otros países, y hemos caracterizado a nivel molecular y estructural las principales proteínas del VLB: la glicoproteína de envoltura (ENV), la cápside (CA) y la proteasa (PR). Asimismo, estudiamos la interacción entre esas proteínas con diferentes componentes de la célula infectada.
Por otro lado, mediante análisis transcriptómico, estudiamos las diferencias de expresión génica entre animales infectados y no-infectados con VLB, para conocer posibles mecanismos involucrados en el control de la infección.
El conocimiento obtenido sobre esta patología y su agente causal nos ha permitido también desarrollar nuevas tecnologías para el diagnóstico tanto a nivel serológico como molecular, así como la generación de preparados inmunogénicos a partir de las proteínas virales que están siendo ensayados en modelos animales.
Los resultados de nuestro trabajo producirán nuevos conocimientos que permitirán comprender mejor los mecanismos que causan la transformación leucémica, generando nuevas herramientas para optimizar su diagnóstico, y nuevos procedimientos para mejorar el control y prevención de la transmisión viral.
Integrantes
Florencia Rammauro, PhD
Asistente de investigación senior honoraria
Facultad de Medicina, Udelar
frammauro@pasteur.edu.uy
Líneas de investigación
Caracterización biofísica y estructural de la proteína de cápside de VLB (CA-VLB).
El mecanismo de formación de la cápside de VLB a través del autoensamblaje de miles de copias de CA-VLB representa un evento clave en el ciclo de este retrovirus. Para comprender este mecanismo hemos caracterizado las propiedades bioquímicas y biofísicas que afectan este proceso y en colaboración con el Laboratorio de Microbiología Molecular y Estructural del IPM elucidamos la estructura tridimensional de CA-VLB, mostrando que se organiza en forma pseudohexagonal con una importante plasticidad conformacional. Por otro lado, generamos nanoanticuerpos dirigidos contra la cápside viral y estudiamos el efecto de la interacción con cápside en la modulación del autoensamblado.
Caracterización de las interacciones entre la CA-VLB y componentes intracelulares de la célula huésped.
El tránsito de la cápside viral entre la membrana plasmática y el núcleo celular depende de la interacción con diversas proteínas celulares. En otros modelos retrovirales se han descripto factores de restricción que perturban la conformación de la cápside generando condiciones anti-virales. Para el caso de los delta-retrovirus como el VLB no tenemos evidencias confirmadas sobre estos mecanismos. En el modelo VIH se ha demostrado que la interacción entre cápside y nucleoporinas participaría en este tránsito y la entrada al núcleo a través del poro nuclear. En función de la capacidad de CA-VLB de autoensamblar in vitro en estructuras supramacromoleculares tubulares o planas, y mediante el uso de técnicas de ologías de espectrometría de afinidad y masa, nuestro objetivo es identificar y caracterizar las interacciones entre BLV CA y los factores del huésped celular involucrados en este tráfico. También buscaremos socios de BLV CA que puedan actuar como sensores inmunes innatos al analizar los lisados celulares de las células permisivas y no permisivas a la infección BLV. Las células de ingeniería generadas por Francesca Di Nunzio en IP Paris, se utilizarán para identificar nuevos factores de restricción o socios virales funcionales mediante espectrometría de masas. También diseñaremos y purificaremos nanoanticuerpos contra BLV CA que serán etiquetados como enfoques de microscopía. Los resultados obtenidos en BLV se transferirán luego a la investigación de HTLV-1 para definir mecanismos comunes y diversos adoptados por estos retrovirus delta al establecer la infección viral.
Caracterización bioquímica, estructural e inmunológica de la proteína de la envoltura BLV.
El complejo de env de BLV tiene un papel crucial en la determinación de la infectividad viral, y es responsable de inducir la fusión de las membranas virales y celulares después del reconocimiento de los receptores específicos de la superficie celular.
Hemos optimizado la expresión del ectodominio de env soluble en células S2 de Drosophila, con un sitio de escisión de furina natural y alterado. La expresión de proteínas y la secreción en el sobrenadante se indujeron mediante metales divalentes, y la purificación de proteínas se realizó por cromatografía de afinidad usando una columna de StrepTactin seguida por cromatografía de exclusión por tamaño. El control de calidad de las proteínas se evaluó mediante espectrometría de masas. Este sistema debería permitir la producción de material suficiente para ensayos de cristalización, crio-microscopía electrónica de trímeros aislados y estudios biofísicos del complejo multimérico formado por las proteínas recombinantes.
Env es uno de los objetivos principales de las respuestas inmunitarias antivirales, que genera tanto anticuerpos neutralizantes humorales como inmunidad adaptativa específica de células T. Se ha informado para otros retrovirus que la presencia de un péptido inmunosupresor (isu) en la estructura de la glicoproteína Env podría ser importante en su capacidad para inmunomodular las respuestas inmunes. Estamos interesados en estudiar el efecto de las modificaciones de aminoácidos en el dominio isu en las respuestas de adaptación humoral y celular frente al desafío con glicoproteínas de Env modificadas. Esto nos permitirá comprender uno de los mecanismos implicados en la generación de resistencia utilizada por BLV para escapar de la respuesta inmune antiviral. Por otro lado, también esperamos identificar las modificaciones que reducen la actividad inmunosupresora de este dominio y, por lo tanto, aumentan su inmunogenicidad. Este resultado podría ser útil para el diseño racional de vacunas efectivas contra este retrovirus.
Mediante el uso de proteína purificada BLV Env también hemos desarrollado una nueva prueba ELISA para usar en el diagnóstico de la leucosis bovina enzoótica. En colaboración con ATGen ahora estamos generando un nuevo kit de diagnóstico EBL que se utilizará en un experimento de campo con más de 50.000 vacas lecheras.
La identificación de características genéticas se asocia con el control natural de EBL.
Dada la alta prevalencia de EBL en Uruguay, la estrategia para erradicar la enfermedad implementada en Europa y Oceanía es impracticable en nuestro país. Una estrategia de control alternativa mediante el uso de vacunas es prometedora, pero todavía no existen productos efectivos en el mercado. Teniendo en cuenta que los resultados recientes muestran que la EBL tiene un componente hereditario que alcanza 8%, una tercera estrategia para controlar la enfermedad involucraría la cría de rebaños al aumentar la frecuencia de genotipos asociados con la resistencia a la infección.
Hemos analizado en un hato experimental con alta prevalencia de infección por BLV, un grupo de animales definidos como «controladores» de la enfermedad y caracterizados por una baja carga proviral y bajos títulos de anticuerpos anti-BLV. Otros grupos se definieron como «no controladores» con alta carga proviral y altos títulos de anticuerpos específicos, y «negativos» sin presencia detectable de BLV.
Mediante el uso de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de estos animales, estamos caracterizando, en colaboración con Natalia Rego y Hugo Naya de la Unidad de Bioinformática IPMON, los representantes transcriptómicos de estos grupos por secuenciación masiva de ARNm (ARNseq). Esperamos identificar genes e isoformas expresados diferencialmente en animales «controladores» e interpretar estas diferencias en el contexto de procesos biológicos, ontologías de vías metabólicas sub o sobrerrepresentadas.
Patentes
- Methods for preparing human thrombopoietin polypeptides by mammalian cell cultures. Cayota A, Robello C, Pritsch O. World International Property Organization: WO0218569 (A3) 2003; USA patent: US7371569 (B2) 2008.
- An antibody specific for the Tn antigen for the treatment of cancer. Hubert-Haddad P, Amigorena S, Sastre X, Osinaga E, Pritsch O, Oppezzo P, Perez F, Moutel S. Europa: EP2014302 (A1) 2009; World International Property Organization: WO2009007222 (A1) 2009, USA patent: US20100278818 A1 2010.
Proyectos
2007 – 2009 – Leucosis Bovina Enzoótica: alternativas de control y desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico. Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) –Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA).
2009 – 2010 – Análisis proteómico del Virus de la Leucosis Bovina. Proyecto I+D financiado por CSIC.
2010 – 2011 – Contribución al desarrollo de la glicoproteómica en el Institut Pasteur Montevideo. Proyecto Transversal Institut Pasteur de Montevideo.
2011 – 2014 – Grupos de Investigación: Inmunología Tumoral. CSIC UdelaR.
2014 – 2017 – Identificación de marcadores moleculares asociados con la resistencia a la infección por el Virus de la Leucosis Bovina mediante análisis transcriptómico de individuos controladores de la carga viral. Fondo INNOVAGRO.
2015 – 2017 – Producción y Caracterización de Inmunógenos contra el Virus de la Leucosis Bovina. CSIC I+D
2014 – 2017 – Laboratoire Franco-Uruguayen de Virologie Structurale – Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), France. Responsables científicos: Otto Pritsch y Félix Rey, Unité de Virologie Structurale – CNRS URA 3015, Institut Pasteur, Paris, France.
2015 – 2018 – Determinación de la carga proviral de Leucosis bovina enzoótica (BLV) por Droplet Digital PCR e interferencia del virus con la respuesta inmune contra patógenos de interés reproductivo. Fondo Sectorial de Salud Animal.
Publicaciones
vacio
2018
- Synthesis of hydrophilic HYNIC-[1,2,4,5]tetrazine conjugates and their use in antibody pretargeting with 99m. García MF,Gallazzi F,de Souza Junqueira M, Fernández M, Camacho X, da Silva Mororó J, Faria D, de Godoi Carneiro C, Couto M, Carrión F, Pritsch O, Chammas R, Quinn T, Cabral P, Cerecetto H. Organic & Biomolecular Chemistry 16(29):5275-5285 2018.
- A novel, smaller scaffold for Affitins: Showcase with binders specific for EpCAM. Kalichuk V, Renodon-Cornière A, Béhar G, Carrión F, Obal G, Maillasson M, Mouratou B, Préat V, Pecorari F. Biotechnol Bioeng. 2018 Feb;115(2):290-299.
2017
- Infección por virus linfotrópico de células T humanas (HTLV) en Uruguay: identificación de problemas. Balduin B, Priore C, Acosta C, Salazar E, Rodríguez F, Bianchi S, Pritsch O. Anales de Facultad de Medicina (Univ Repúb Urug) 4 (Supl 1): 41-51, 2017.
- Functional diversity of secreted cestode Kunitz proteins: Inhibition of serine peptidases and blockade of cation channels. Fló M., Margenat M., Pellizza L., Graña M., Durán R., Báez A., Salceda E., Soto E., Alvarez B., Fernández C. 2017. PLoS Pathogens. 13(2):e1006169
2016
- Effective anti-tumor therapy based on a novel antibody drug-conjugate targeting the Tn carbohydrate antigen. Sedlik C, Heitzmann A, Viel S, Ait Sarkouh R, Batisse C, Schimdt F, De La Rochere P, Amzallag N, Osinaga E, Oppezzo P, Pritsch O, Sastre-Garau X, Hubert P, Amigorena S, Piaggio E. Oncoimmunology Apr 22;5(7):e1171434, 2016.
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- Regulation of signaling directionality revealed by 3D snapshots of a kinase:regulator complex in action. Trajtenberg F, Imelio JA, Machado MR, Larrieux N, Marti MA, Obal G, Mechaly AE, Buschiazzo A. Elife. 2016 Dec 12;5. pii: e21422.
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2015
- New potential eukaryotic substrates of the mycobacterial protein tyrosine phosphatase PtpA: hints of a bacterial modulation of macrophage bioenergetic state mitochondrial functions. Margenat M, Labandera A, Gil M, Carrión F, Purificação M, Razzera G, Portela MM, Obal G, Terenzi H, Pritsch O, Durán R, Ferreira AM, Villarino A. Scientific Reports 5: 8819: DOI: 10.1038, 2015
- Conformational plasticity of the native retroviral capsid revealed by X ray crystallography. Obal G, Trajtenberg F, Carrión F, Tomé L, Larrieux N, Zhang X, Pritsch O, Buschiazzo A. Science 349(6243):95-98, 2015.
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- HemR is an OmpR/PhoB-like response regulator from Leptospira, which simultaneously effects transcriptional activation and repression of key haem metabolism genes. Morero NR, Botti H, Nitta KR, Carrión F, Obal G, Picardeau M, Buschiazzo A. Mol Microbiol. 2014 Oct;94(2):340-52.
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- Generation of a vector suite for protein solubility screening. Correa A, Ortega C, Obal G, Alzari P, Vincentelli R, Oppezzo P. Front Microbiol. 2014 Feb 25;5:67.
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- A detailed molecular analysis of complete Bovine Leukemia Virus genomes isolated from B-cell lymphosarcomas. Moratorio G, Fisher S, Bianchi S, Tome L, Rama G, Obal G, Carrion F, Pritsch O, Cristina J. (PMID: 23506507) Veterinary Research, 44(1): 19, 2013.
- Monoclonal antibodies toward different Tn-amino acid backbones display distinct recognition patterns on human cancer cells. Implications for effective immuno-targeting of cancer. Mazal D, Lo-Man R, Bay S, Pritsch O, Dériaud E, Ganneau C, Medeiros A, Ubillos L, Obal G, Berois N, Bolatti-Fogolin M, Leclerc C, Osinaga E. (PMID: 23604173) Cancer Immunology and Immunotherapy 62: 1107-1122, 2013
- Avances en el conocimiento de la vaca lechera durante el período de transición en Uruguay: un enfoque multidisciplinario. Meikle A, Cavestany D, Carriquiry M, Adrien ML, Artegoitia V, Pereira I, Ruprechter G, Pessina P, Rama G, Fernandez A, Breijo M, Laborde D, Pritsch O, Ramos JM, de Torres E, Nicolini P, Mendoza A, Dutour J, Fajardo M, Astessiano AL, Olazábal L, Mattiauda D, Chilibroste P. Agrociencia Uruguay 17(1): 141-152, 2013.
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- Search for an aetiological virus candidate in chronic lymphocytic leukaemia by extensive transcriptome analysis. Rego N, Bianchi S, Moreno P, Persson H, Kvist A, Pena A, Oppezzo P, Naya H, Rovira C, Dighiero G, Pritsch O. (PMID: 22489537) British Journal of Haematology 157(6):709-17, 2012.
- The crystal structure of the MAP kinase LmaMPK10 from Leishmania major reveals parasite-specific features and regulatory mechanisms. Horjales S, Schmidt-Arras D, Limardo RR, Leclercq O, Obal G, Prina E, Turjanski AG, Späth GF, Buschiazzo A. Structure. 2012 Oct 10;20(10):1649-60.
- Characterisation of the native lipid moiety of Echinococcus granulosus antigen B. Obal G, Ramos AL, Silva V, Lima A, Batthyany C, Bessio MI, Ferreira F, Salinas G, Ferreira AM. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(5):e1642
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- Serine / threonine protein kinase PrkA of Listeria monocytogenes: biochemical characterization and identification of interacting partners through proteomic approaches. Lima A, Durán R, Schujman G, Marchissio MJ, Portela MM, Obal G, Pritsch O, de Mendoza D, Cerveñansky C. (PMID:21406257) Journal of Proteomics 74(9):1720-34, 2011.
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- Crystal structure of an enzymatically inactive trans-sialidase-like lectin from Trypanosoma cruzi: The carbohydrate binding mechanism involves residual sialidase activity. Oppezzo P, Obal G, Baráibar M, Pritsch O, Alzari PM, Buschiazzo A. (PMID: 21570497) Biochimica et Biophysica Acta 1814(9): 1154-1161, 2011.
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- Competitive selection from single domain antibody libraries allows isolation of high-affinity antihapten antibodies that are not favored in the llama immune response. Tabares-da Rosa S, Rossotti M, Carleiza C, Carrión F, Pritsch O, Ahn KC, Last JA, Hammock BD, González-Sapienza G. (PMID: 21827167) Analytical Chemistry 83(18):7213-7220, 2011.
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- Immunoglobulin heavy chain V-D-J gene rearrangement and mutational status in Uruguayan patients with chronic lymphocytic leukemia. Bianchi S, Moreno P, Landoni AI, Naya H, Oppezzo P, Dighiero G, Gabús R, Pritsch O. (PMID: 20929321) Leukemia & Lymphoma 51 (11): 2070-2078, 2010.
- Estudio comparativo de tres técnicas diagnósticas para la Leucosis Enzoótica Bovina y análisis del efecto de enfermedades concurrentes sobre la fórmula leucocitaria. Rama G, ,Meikle A ,Puentes R, Moratorio G, Nicolini P, Pessina P, Furtado A, Pritsch O. Veterinaria (Montevideo) 46: 15-22, 2010.
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- Use of diaminofluoresceins to detect and measure nitric oxide in low level generating human immune cells. Tiscornia A, Cairoli E, Marquez M, Denicola A, Pritsch O, Cayota A. Journal of Immunological Methods 342(1-2):49-57, 2009.
- A global benchmark study using affinity-based biosensors. Rich RL, Papalia GA, Flynn PJ, Furneisen J, Quinn J, Klein JS, Katsamba PS, Waddell MB, Scott M, Thompson J, Berlier J, Corry S, Baltzinger M, Zeder-Lutz G, Schoenemann A, Clabbers A, Wieckowski S, Murphy MM, Page P, Ryan TE, Duffner J, Ganguly T, Corbin J, Gautam S, Anderluh G, Bavdek A, Reichmann D, Yadav SP, Hommema E, Pol E, Drake A, Klakamp S, Chapman T, Kernaghan D, Miller K, Schuman J, Lindquist K, Herlihy K, Murphy MB, Bohnsack R, Andrien B, Brandani P, Terwey D, Millican R, Darling RJ, Wang L, Carter Q, Dotzlaf J, Lopez-Sagaseta J, Campbell I, Torreri P, Hoos S, England P, Liu Y, Abdiche Y, Malashock D, Pinkerton A, Wong M, Lafer E, Hinck C, Thompson K, Primo CD, Joyce A, Brooks J, Torta F, Bagge Hagel AB, Krarup J, Pass J, Ferreira M, Shikov S, Mikolajczyk M, Abe Y, Barbato G, Giannetti AM, Krishnamoorthy G, Beusink B, Satpaev D, Tsang T, Fang E, Partridge J, Brohawn S, Horn J, Pritsch O, Obal G, Nilapwar S, Busby B, Gutierrez-Sanchez G, Gupta RD, Canepa S, Witte K, Nikolovska-Coleska Z, Cho YH, D’Agata R, Schlick K, Calvert R, Munoz EM, Hernaiz MJ, Bravman T, Dines M, Yang MH, Puskas A, Boni E, Li J, Wear M, Grinberg A, Baardsnes J, Dolezal O, Gainey M, Anderson H, Peng J, Lewis M, Spies P, Trinh Q, Bibikov S, Raymond J, Yousef M, Chandrasekaran V, Feng Y, Emerick A, Mundodo S, Guimaraes R, McGirr K, Li YJ, Hughes H, Mantz H, Skrabana R, Witmer M, Ballard J, Martin L, Skladal P, Korza G, Laird-Offringa I, Lee CS, Khadir A, Podlaski F, Neuner P, Rothacker J, Rafique A, Dankbar N, Kainz P, Gedig E, Vuyisich M, Boozer C, Ly N, Toews M, Uren A, Kalyuzhniy O, Lewis K, Chomey E, Pak BJ, Myszka DG. Analytical Biochemistry 386(2):194-216, 2009.
2008
- Small RNAs analysis in CLL reveals a deregulation of miRNA expression and novel miRNA candidates of putative relevance in CLL pathogenesis. Marton S, Garcia MR, Robello C, Persson H, Trajtenberg F, Pritsch O, Rovira C, Naya H, Dighiero G, Cayota A. Leukemia 22: 330-338, 2008.
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- High throughput method for ranking the affinity of peptide ligands selected from phage display libraries. González-Techera A., Cardozo S., Obal G., Pritsch O., Last J., Gee S., Hammock and González-Sapienza G. Bioconjugate Chemistry 19: 993-1000, 2008
- Regulation of glutamate metabolism by protein kinases in mycobacteria. O’Hare HM, Durán R, Cerveñansky C, Bellinzoni M, Wehenkel AM, Pritsch O, Obal G, Baumgartner J, Vialaret J, Alzari PM, Johnsson K. Molecular Microbiology, 70(6): 1408-1423, 2008.